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摘要近年来，不孕不育患者逐年增加，人类生殖健康正面临巨大挑战。男性因素约占不孕不育的30％-50％,主要原因是精子发生障碍，表现为少型精子症，弱型精子症，畸型精子症，以及最严重的无精症。<br>　　精子形成(spermiogenesis)是发生在减数分裂之后圆形精子经过包括顶体和鞭毛形成、细胞核压缩、细胞质丢弃等复杂变化，最终形成成熟精子的过程。小鼠的精子形成可细化为16个连续转化时期，这些连续转化时期受到一系列特异性表达基因的精密调控，任何一个阶段的异常都将导致精子形成的失败并引起雄性不育。鉴定精子形成过程中关键分子并深入探究其参与精子形成的分子机制，将对男性不育的诊断、治疗提供理论依据和治疗思路。<br>　　跨膜通道样(Transmembrane channel-like，TMC)蛋白是一类进化上高度保守的跨膜蛋白，含有6-10个跨膜结构域，在哺乳动物中共有8个家族成员(TMC1-TMC8)。TMC1和TMC2在听觉和平衡觉的机械感受细胞中表达，Tmc1基因突变是家族遗传性耳聋的常见病因，人们对其他TMC家族成员的生理功能认识较少。本论文发现Tmc7是睾丸特异表达的TMC家族成员，通过构建Tmc7全身性敲除小鼠，探究了 TMC7在精子形成过程中的作用及分子机制，主要结果如下:<br>　　1.Tmc7在小鼠睾丸中特异性高表达，Tmc7-/-雄性小鼠不育<br>　　利用小鼠发育转录组数据库(E-MTAB-6798)分析发现在Tmc家族中Tmc7在睾丸中特异表达;分析小鼠和人类睾丸单细胞数据发现Tmc7在双线期的精母细胞中开始表达，在圆形精子及成熟精子中高表达，提示Tmc7可能在精子发生后期发挥重要作用。利用CRISPR/Cas9技术构建Tmc7全身性敲除小鼠，发现Tmc7-/-雄性小鼠睾丸体积明显小于对照组，进一步研究发现Tmc7-/-雄性小鼠完全不育。<br>　　2.TMC7的缺失导致小鼠精子形成障碍<br>　　为探究TMC7缺失导致小鼠雄性不育的原因，通过对不同发育阶段小鼠睾丸组织进行苏木素染色，对曲细精管进行病理分析发现PD28（postnatal day）起，Tmc7-/-小鼠的曲细精管中延长型精子与对照组相比数量显著减少;对小鼠曲细精管中不同发育时期的精子细胞计数发现，9W（Weeks）Tmc7-/-曲细精管中处于9-12期的精子细胞数量较对照组开始出现降低，13-16期的精子细胞数量降低尤为显著;此外曲细精管中还观察到畸形精子以及曲细精管的空泡化;Tmc7-/-小鼠附睾尾中含有大量脱落的圆形细胞以及头部明显畸形的精子，附睾尾中获得的精子数量显著低于对照组;免疫荧光染色对小鼠精子尾部线粒体鞘染色，发现Tmc7-/-小鼠精子线粒体鞘分布异常;同时精子活力分析发现，Tmc7-/-小鼠精子表现为运动能力的完全丧失。以上结果表明Tmc7-/-小鼠精子形成异常，其表型与人类少弱畸型精子症（OAT）相似。<br>　　3.TMC7定位于高尔基体顺面，其缺失导致高尔基体结构破坏和功能受损，顶体形成受阻<br>　　为阐明TMC7缺失引起小鼠精子形成过程受阻的机制，利用免疫组化染色实验发现TMC7在粗线期精母细胞以及圆形精子细胞核周表达;利用免疫荧光共染色实验发现TMC7能够与高尔基体标志物（GM130）共定位，提示TMC7定位于精子细胞高尔基体顺面;通过透射电镜以及免疫荧光染色发现，Tmc7-/-小鼠精子细胞高尔基体结构异常，呈碎裂状;Tmc7-/-小鼠精子细胞顶体附近存在大量的囊泡、顶体形态异常、顶体质膜间隙增加;PNA染色发现，Tmc7-/-小鼠的顶体在早期高尔基体阶段（2-3期）开始出现异常;Tmc7-/-小鼠精子细胞中GM130与PNA、GOPC与PNA免疫荧光共染提示高尔基体来源的前顶体囊泡不能与顶体融合。这些结果表明TMC7的缺失会导致高尔基体结构破坏和功能受损，高尔基体来源的前顶体囊泡不能与顶体融合，顶体形成受阻。<br>　　4.TMC7缺失引起精子细胞内离子稳态失衡、精子细胞凋亡<br>　　为深入探究TMC7缺失导致高尔基体结构破坏和功能受损的机制和后果，本论文首先利用流式检测了原代精子细胞内离子浓度的变化，结果发现Tmc7-/-小鼠精子细胞内Ca2+浓度明显低于对照组，且Tmc7--小鼠精子细胞内PH值升高、ROS水平升高，表明Tmc7-/-小鼠精子细胞内离子稳态失衡;利用Western Blot检测高尔基应激相关蛋白HSP47、TFE3的表达水平，发现其在Tmc7-/-小鼠精子细胞中明显升高，提示Tmc7-/-小鼠精子细胞内发生了高尔基体应激;同时在Tmc7-/-小鼠精子细胞中还检测到了内质网应激的发生，在Tmc7-/-小鼠精子细胞中内质网应激相关蛋白GRP78、CHOP、p-EIF2α的表达水平较对照组显著升高;通过TUNEL染色等实验发现，9W的Tmc7-/-小鼠曲细精管及附睾尾中有大量的凋亡细胞。上述结果表明，TMC7缺失引起精子细胞内离子稳态失衡，引发高尔基体和内质网应激，并最终导致精子细胞凋亡。<br>　　总结及研究意义:本论文发现Tmc7在小鼠睾丸中特异性高表达，通过构建TMC7全身性敲除小鼠模型，发现Tmc7-/-雄性小鼠不育;对TMC7在精子形成中的作用及机制进行探究，发现TMC7定位于精子细胞高尔基体顺面，其缺失会导致高尔基体来源的前顶体囊泡无法与顶体融合形成完整的顶体，顶体形成过程受阻，同时在Tmc7-/-小鼠中还发现精子线粒体鞘分布异常、精子数量显著降低以及精子细胞的凋亡，这与人类的少弱畸形精子症(OAT)表型相似。综上，本论文的研究结果证明了 TMC7在小鼠精子形成过程中发挥重要作用。