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摘要卵巢癌是死亡率最高的妇科恶性肿瘤，2020年全球新发病例31.4万例，死亡20.7万例。根据国家癌症中心(National Cancer Center China,NCCC)2022年公布的数据，2016年中国新发卵巢癌约5.7万例，较以往同期呈上升趋势，死亡约2.7万例，是死亡率最高的妇科恶性肿瘤。晚期卵巢癌占比超过70％，5年生存率不足40％。最常见的卵巢癌是高级别浆液性癌(High-grade serous ovarian cancer,HGSOC)。<br>　　聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly ADP-ribose polymerase,PARP)抑制剂的出现显著改善了卵巢癌患者的预后。大量临床研究证实，PARP抑制剂的最佳获益人群是同源重组修复缺陷(Homologous recombination deficiency，HRD)阳性患者，HRD阴性患者获益有限。而仅有大约50％的HGSOCs存在HRD，其余卵巢癌患者对PARP抑制剂反应不佳，获益有限。目前临床上亟需进一步开发有效的治疗策略以期克服PARP抑制剂耐药并扩大PARP抑制剂的适宜人群。<br>　　细胞周期蛋白依赖性激酶16(Cyclin-dependent kinase 16,CDK16)是一种不典型的细胞周期蛋白依赖性激酶。近年来的研究发现，CDK16在卵巢癌、肺癌、肾癌、乳腺癌和肝细胞癌等中普遍高表达，在肿瘤细胞增殖、转移与侵袭等过程中发挥重要作用。最新研究发现，多个癌种中CDK16高表达均与不良预后密切相关。我们通过泛癌分析证实，CDK16在很多恶性肿瘤中均高表达，在卵巢癌中表达尤为明显。CDK16高表达比低表达患者的无进展生存期(Progression-free survival,PFS)和总生存期(Overall survival,OS)更短，预后更差。然而CDK16在卵巢癌中的作用及其机制尚未阐明。<br>　　第一部分:CDK16在卵巢癌中的表达、临床意义及生物学功能<br>　　研究目的和方法:<br>　　探究CDK16在卵巢癌中的表达水平，分析其与预后之间的关系，并进一步探究其在卵巢癌中的生物学功能及机制。本部分分析了 TCGA和GTEX数据库中CDK16在卵巢癌和正常卵巢组织中表达的差异;收集临床标本，通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR,以下简称qPCR)、Western Blot和免疫组化对卵巢癌和正常卵巢/输卵管组织中CDK16的表达进行验证;通过Kaplan-Meier分析CDK16高表达对卵巢癌预后的影响。建立CDK16敲低和过表达卵巢癌细胞系并验证，通过CCK-8增殖实验、平板克隆实验、EdU荧光标记实验、免疫荧光和流式细胞术等实验探究CDK16对卵巢癌增殖与凋亡的影响;并通过RNA-seq、免疫沉淀联合质谱分析、Western Blot和免疫荧光染色等技术初步探究其分子机制。<br>　　研究结果:<br>　　生信分析、免疫组化和qPCR结果显示，CDK16在卵巢癌中高表达，并与不良预后相关。敲低CDK16抑制卵巢癌细胞系(Hey、OVCAR8、OVCAR3、OV90、A2780、SKOV3)的增殖，而过表达则促进其增殖。敲低CDK16促进卵巢癌细胞系Hey和A2780的凋亡，而高表达则抑制顺铂诱导的凋亡。RNA-seq结果分析显示，敲低CDK16后，差异基因在细胞周期、DNA合成与代谢、DNA同源复制等生物过程中富集，质谱分析结果显示，CDK16的结合蛋白在细胞周期、DNA复制等生物过程中富集。通过Western Blot和免疫荧光焦点实验证实，敲低CDK16促进卵巢癌细胞系Hey和SKOV3的DNA损伤。<br>　　上述结果表明，CDK16在卵巢癌中高表达，并与不良预后相关。敲除CDK16可以抑制卵巢癌增殖，并促进卵巢癌DNA损伤和凋亡。<br>　　第二部分:靶向CDK16的反义寡核苷酸在卵巢癌中的抗肿瘤作用及机制<br>　　研究目的和方法:<br>　　设计靶向CDK16可变剪接的反义寡核苷酸(Antisense oligonucleotide,ASO),验证其对内含子保留的促进作用、对CDK16的敲低作用及对卵巢癌的抑制作用。本论文根据CDK16内含子I9和I10正常剪接时可能的剪接位点，设计4条硫代磷酸酯键修饰的ASO。利用qPCR和半定量PCR验证ASO对内含子保留的促进作用。利用qPCR和Western Blot验证其对CDK16的敲低效率。CCK-8试验计算四条ASO对于不同卵巢癌细胞系(Hey、OVCAR8、OVCAR3、OV90、A2780、SKOV3)的半抑制浓度(The half maximal inhibitory concentration,IC50)。通过CCK-8增殖实验、平板克隆实验、EdU荧光标记实验、流式细胞学、免疫荧光和Western Blot等方法验证ASO对卵巢癌细胞的抑制作用。<br>　　研究结果:<br>　　与正常输卵管或卵巢组织相比，卵巢癌组织中转录本CDK16-203的表达和占比均明显下调，而编码蛋白的转录本CDK16-211明显上调，而且卵巢癌组织中I9和I10的内含子保留均明显下调。靶向CDK16的ASO1和ASO3可以促进I9和I10的内含子保留，并通过无义介导的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay,NMD)途径降解，从而敲低CDK16的表达。ASO1和ASO3均可以抑制卵巢癌细胞系(Hey、OVCAR8、OV90、A2780、SKOV3)的增殖，促进卵巢癌细胞系Hey和A2780的凋亡，并促进卵巢癌细胞系Hey和SKOV3的DNA损伤。<br>　　上述结果显示，靶向CDK16可变剪接的ASO1和ASO3通过促进I9和I10的内含子保留，导致编码蛋白的转录本显著减少从而下调CDK16的表达水平，进而抑制卵巢癌增殖并促进DNA损伤，诱导肿瘤细胞凋亡。<br>　　第三部分:靶向CDK16的ASO与奥拉帕利联用发挥协同抗肿瘤作用<br>　　研究目的和方法:<br>　　本部分拟评估和验证靶向CDK16的ASO与奥拉帕利(Olaparib)联用是否存在协同抗肿瘤作用。首先根据Chou-Talalay方法，使用Compusyn软件，通过联用指数(combination index,CI)和抑制率-联合指数图评估ASO1/3与奥拉帕利的协同作用。通过CCK-8增殖实验、平板克隆实验、EdU荧光标记实验、免疫荧光和流式细胞术等实验，对ASO1和ASO3与奥拉帕利在抑制卵巢癌增殖和促进卵巢癌DNA损伤及凋亡方面的协同作用进行验证。进一步通过建立小鼠皮下移植瘤模型进行体内验证。<br>　　研究结果:<br>　　Chou-Talalay方法结果证实，ASO1和ASO3与奥拉帕利联用在高抑制率时均表现为较强的协同作用。进一步验证结果显示，ASO1和ASO3与奥拉帕利联用在抑制卵巢癌细胞系(Hey、A2780和SKOV3)的增殖、促进卵巢癌细胞系Hey和A2780凋亡和促进卵巢癌细胞系Hey和SKOV3的DNA损伤等方面有明显的协同作用。体内实验证实，mCDK16-ASO3与奥拉帕利联用与单用ASO或奥拉帕利比，可以进一步抑制肿瘤生长。<br>　　以上结果表明，靶向CDK16可变剪接的ASO1和ASO3与奥拉帕利发挥协同抗肿瘤作用。<br>　　研究结论及意义:<br>　　本研究证实CDK16在卵巢癌中高表达，并与不良预后相关。敲除CDK16可以抑制卵巢癌增殖，促进卵巢癌DNA损伤和凋亡。本研究所设计靶向CDK16可变剪接的ASO1和ASO3,通过促进I9和I10的内含子保留，导致编码蛋白的转录本显著减少从而下调CDK16的表达，进而抑制卵巢癌增殖并促进DNA损伤，诱导肿瘤细胞凋亡。靶向CDK16可变剪接的ASO1和ASO3与奥拉帕利可发挥协同抗肿瘤作用，为卵巢癌提供了新的治疗策略，为克服PARP抑制剂耐药和扩大PARP抑制剂的获益人群提供了新的可能靶点。