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袖状胃切除术对肝脏代谢状态的改善作用及相关机制研究

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摘要研究目的 　　非酒精性脂肪性肝病(Nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是当今我国最常见的肝脏疾病类型，如不进行早期干预，往往进展成非酒精性脂肪性肝炎(Nonalcoholic steatohepatitis,NASH)甚至肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)。然而，目前尚无任何药物获批用于治疗这类疾病。减重手术是治疗该类疾病的主要方式，但其发挥作用的机制尚不明确。 　　袖状胃切除术是当今治疗能量代谢相关疾病最流行的减重手术方式，其在减轻体重和改善糖脂代谢中的作用在治疗非酒精性脂肪性肝病的过程中至关重要，但其产生的如此优秀的治疗效果的根本机制仍然存在大片的空白。本课题旨在探索袖状胃切除术对非酒精性脂肪性肝病的代谢改善效果，尝试性地提出一种全新的机制理论用以阐释袖状胃切除术对肝脏代谢的改善作用，为该领域的研究提供全新的线索和思路，为研究者更好的理解袖状胃切除术在肝脏中的作用提供理论基础。 　　第一部分袖状胃切除术对饮食诱导肥胖小鼠的代谢改善效果 　　材料方法 　　1.1检测袖状胃切除术对饮食诱导肥胖小鼠体重的影响 　　对24只饮食诱导肥胖C57BL/6N小鼠随机分组进行袖状胃切除术(15只小鼠)和假手术(9只小鼠)并记录每周的体重变化。手术开始前称重记为初始体重，自手术日起每隔7日记录一次体重，术后第42日记录体重后处死小鼠收集血清和肝脏样本。记录的体重数据使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析。 　　1.2检测袖状胃切除术对饮食诱导肥胖小鼠糖耐量和胰岛素敏感性的影响 　　1.2.1检测袖状胃切除术对饮食诱导肥胖小鼠糖耐量的影响 　　术后第4周对两组小鼠(每组6只)进行糖耐量试验(Intraperitoneal Glucose Tolerance Test,IPGTT),记录血糖数据并使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析。 　　1.2.2检测袖状胃切除术对饮食诱导肥胖小鼠胰岛素敏感性的影响 　　术后第5周对两组小鼠(每组5只)进行胰岛素耐量试验(Insulin Tolerance Test,ITT),记录血糖数据并使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析。应用ELISA检测法检测小鼠血清中的胰岛素水平，计算两组小鼠的HOMA-IR值。记录的血糖数据和HOMA-IR值使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析。 　　1.3检测袖状胃切除术对饮食诱导肥胖小鼠肝功能的影响 　　术后第6周，处死小鼠并收集标本，肝脏大体观拍照，计算肝脏体重比，然后切取部分肝右叶置于多聚甲醛溶液中固定，制片并进行HE染色。收集血清样本使用生化分析仪进行肝功能检测，主要检测包括ALT、AST、HDL-c、LDL-c、LDH和SOD水平。使用Graph Pad Prism 8.0.1软件对肝体比和血清检测结果进行作图和统计学分析。 　　1.4检测袖状胃切除术对肝脏糖脂代谢相关分子表达和组织学的影响 　　应用qRT-PCR方法检测两组小鼠肝脏中与糖脂代谢高度相关的基因表达水平，包括Srebf1、Hmgcs2、Cd36、Fasn、Scd1等。多聚甲醛固定的肝脏样本切片进行油红O染色和PAS糖原染色。使用Graph Pad Prism 8.0.1软件对qRT-PCR结果进行作图和统计学分析。 　　实验结果 　　1.1袖状胃切除术产生饮食诱导肥胖小鼠体重减轻表型并持续存在 　　术后的体重监测结果显示袖状胃切除术能够显著减轻饮食诱导肥胖小鼠的体重，在给予全程高脂饮食喂养的情况下，袖状胃切除术组小鼠的体重稳定地低于假手术组小鼠的体重。 　　以上结果表明，袖状胃切除术产生体重减轻的表型在饮食诱导肥胖小鼠模型上持续存在，这是其具有的整体性代谢改善能力的重要表现。 　　1.2袖状胃切除术改善饮食诱导肥胖小鼠糖耐量并恢复胰岛素敏感性 　　1.2.1袖状胃切除术改善饮食诱导肥胖小鼠糖耐量 　　IPGTT试验结果显示袖状胃切除术组小鼠的糖耐量得到明显改善，曲线下面积明显减小。 　　1.2.2袖状胃切除术恢复饮食诱导肥胖小鼠胰岛素敏感性 　　ITT试验结果显示袖状胃切除术组小鼠的胰岛素敏感性得到明显改善，曲线下面积明显减小。袖状胃切除术组小鼠的HOMA-IR值明显小于假手术组小鼠。以上的结果表明袖状胃切除术能够恢复饮食诱导肥胖小鼠受损的胰岛素敏感性。 　　1.3袖状胃切除术显著改善饮食诱导肥胖小鼠肝功能 　　肝脏大体观显示出袖状胃切除术后小鼠肝脏呈现红润的色泽，体积较假手术组明显缩小;肝体比相对于假手术组较小;袖状胃切除术组小鼠血清中的ALT、HDL-c、LDL-c、LDH和SOD水平均较低，而AST水平无明显差异;肝脏切片HE染色的结果表现出袖状胃切除术后的肝脏一般状态良好，具有较少的脂肪空泡和较少的形态异常的肝细胞。 　　以上的结果提示袖状胃切除术在整体上改善了饮食诱导肥胖小鼠的非酒精性脂肪肝状态。 　　1.4袖状胃切除术产生糖脂代谢改善的分子表型和组织学表型 　　qRT-PCR结果显示袖状胃切除术后，小鼠肝脏中的多种与糖脂代谢相关的基因表达出现了明显的变化;油红O染色的结果显示出袖状胃切除术组小鼠肝脏中的脂质沉积明显低于假手术组小鼠的肝脏;糖原染色的结果显示袖状胃切除术组小鼠的肝脏内有相较于假手术组更多的糖原合成。以上的结果表明袖状胃切除术能够产生糖脂代谢改善的分子表型，并在组织学上表现为脂质沉积减少和糖原合成增强。 　　第二部分对袖状胃切除术后肝细胞分布特征相关生物学行为的揭示 　　材料方法 　　2.1检测袖状胃切除术后肝脏组织学变化的特征内涵 　　在术后第6周处死手术干预小鼠之前的48h对小鼠进行腹腔注射BrdU标记，处死后收集肝脏样本制片进行BrdU免疫荧光染色、Ki67免疫荧光染色和Pcna免疫组织化学染色。使用ImageJ软件分析染色结果中的阳性细胞比率，得到的数据使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析。 　　2.2检测袖状胃切除术增强肝再生的相关分子表征 　　应用qRT-PCR方法检测两组小鼠肝脏中与经典再生信号相关的基因表达水平，包括 Socs3、Myc、Egfr、Ccne1、Sox9 等，使用 Graph Pad Prism 8.0.1 软件进行作图和统计学分析。应用Western blot技术检测手术干预后小鼠肝脏内的Stat3的蛋白表达水平，应用免疫荧光染色技术检测Stat3蛋白的磷酸化形式在肝脏中的亚细胞定位。 　　2.3鉴定袖状胃切除术产生的肝再生增强的完整性 　　多聚甲醛固定的肝脏样本切片进行Albumin、Cd326和α-sma蛋白的免疫荧光染色和天狼猩红染色。 　　2.4利用单细胞转录组学技术阐释袖状胃切除术增强的肝细胞再生过程 　　2.4.1对手术干预后的肝细胞进行重新分群 　　收集小鼠术后新鲜肝脏制备单细胞悬液后进行单细胞转录组学分析，通过UMAP算法将所得到的数据降维并对肝细胞群体重新分群和聚类，再对亚群UMAP结果进行袖状胃切除术组和假手术组标识，并用饼图的形式表示各亚群在两组中的占比。 　　2.4.2对重新分群的肝细胞亚群进行功能注释 　　对单细胞转录组学肝细胞亚群结果进行通路分析和Qusage分析，并籍此对各亚群进行功能注释。 　　2.4.3对单细胞转录组学结果的基础实验验证 　　提取各个肝细胞亚群的特征基因，分离术后小鼠原代肝细胞，应用qRT-PCR方法检测最具代表性的特征基因表达水平，包括假手术组中的Hmgcs1、Ftl1、Fabp2、Fabp1、Atp5g1 和袖状胃切除术组中的 Saa2、Orm1、Mt2、Mlxipl 和 Gcgr,使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析。 　　2.5利用空间转录组学技术对单细胞转录组学结果进行补充 　　2.5.1揭示手术干预后不同肝细胞亚群的空间分布特点 　　OCT包埋小鼠肝脏组织后切片进行HE染色，在同层附近切取组织切片用于空间转录组学分析。将2.4中的亚群结果向空间转录组学映射。对空间转录组结果进行PCA分析和UMAP降维，并将2.4.2中的结果对其进行染色和分析。 　　2.5.2揭示不同肝细胞亚群标志基因的组织学分布特点并验证 　　对带有组织学信息的空间转录组学结果进行通路分析，选择反映各亚群功能的典型通路中的基因对空间转录组学结果进行染色。分离术后小鼠原代肝细胞，应用qRT-PCR方法检测前述通路分析中的基因表达水平，使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析。 　　实验结果 　　2.1袖状胃切除术产生肝脏再生增强的组织学表型 　　BrdU免疫荧光染色结果显示，袖状胃切除术组小鼠的肝脏再生信号明显比假手术组小鼠的肝脏中的再生信号更强，Ki67免疫荧光染色和Pcna免疫组织化学染色也表现出类似的结果，提示袖状胃切除术后小鼠肝脏中存在相较于假手术组更强的再生信号。 　　2.2袖状胃切除术产生肝脏再生增强的分子表型 　　qRT-PCR结果显示，与假手术组相比，袖状胃切除术组小鼠肝脏中肝再生相关基因的表达显著增加;Western blot结果显示，袖状胃切除术组小鼠肝脏中的Stat3蛋白表达水平升高，Pcna蛋白和Stat3蛋白在细胞核内的表达水平升高;Stat3ser727免疫荧光染色的结果显示Stat3在袖状胃切除术组小鼠肝脏中存在明显的核异位，而在假手术组中则罕有阳性信号。 　　2.3袖状胃切除术产生的肝脏再生增强涉及多种细胞类型 　　免疫荧光染色的结果显示，袖状胃切除术组小鼠肝脏中存在更高比例的能够高表达Albumin蛋白的肝细胞，胆管上皮细胞的数量也更多。不仅如此，袖状胃切除术组小鼠肝脏中的肝星状细胞产生的细胞外基质包括α-sma和Ⅰ型胶原也更多。这提示了前述结果中袖状胃切除术组小鼠肝脏中更强的再生信号是完整的肝再生过程的增强，而非假阳性结果。上述结果表明，袖状胃切除术后，小鼠肝脏中与肝脏代谢改善在组织学上存在高相似度的生物过程是肝再生的增强。 　　2.4单细胞转录组学技术阐释袖状胃切除术增强的肝细胞再生过程 　　2.4.1单细胞转录组学揭示袖状胃切除术后肝细胞亚群分布变化 　　单细胞转录组学共捕获术后小鼠肝脏中12种细胞类型，UMAP算法降维后对肝细胞群体重分群得到3个肝细胞亚群，分别为Cluster0,Cluster1,Cluster2,在假手术组肝细胞中所占比例分别为9.60％、76.70％和13.70％,在袖状胃切除术组肝细胞中占比分别为54.90％、8.00％和37.10％，以上的结果表明，假手术组小鼠肝脏中肝细胞的主力群体是Cluster1,而Cluster0和Cluster2的比例都相对较低;袖状胃切除术组小鼠的肝脏中，肝细胞的主力群体是Cluster0和Cluster2,Cluster1类型的肝细胞相对罕见。以上结果提示，不同小鼠肝脏中主力肝细胞的类型可能与其表现出的功能状态相关。 　　2.4.2袖状胃切除术后不同肝细胞亚群的功能注释 　　通路分析结果显示，Cluster0与肝脏正常的代谢功能相关，将其注释为正常的工作肝细胞群体;Cluster1与非酒精性脂肪性肝病的疾病进程相关，将其注释为功能受损的NAFLD相关群体;Cluster2与再生相关的信号通路，将其注释为再生肝细胞群。Qusage分析的结果显示，代谢相关的基因集在Cluster0群体中高度富集，Cluster1细胞群中非酒精性脂肪性肝病相关的基因集呈现突出的优势，而Cluster2细胞群中与再生相关的基因集表达显著上调。Qusage分析的结果与通路分析的结果相吻合，并且其主力细胞群体所具有的功能也与前述的两组小鼠肝脏的组织学特点相一致。 　　2.4.3肝细胞亚群标志基因的表达验证 　　qRT-PCR结果显示，Cluster1细胞群的特征基因在假手术组中的表达水平明显更高，而Cluster0和Cluster2细胞群的特征基因在袖状胃切除术组中的表达水平则明显高于假手术组。以上结果表明，单细胞转录组学分析给出的亚细胞群体功能划分能够与两组小鼠肝细胞主要特点相吻合。 　　2.5空间转录组学对单细胞转录组学结果的补充完善 　　2.5.1空间转录组学表征不同亚群肝细胞的空间分布 　　2.4中亚群结果向空间转录组学映射的结果显示，Cluster0在袖状胃切除术组肝脏中表现出广泛且高丰度的分布，而在假手术组中的丰度相对较低，特别是脂化严重的区域，这一差异更加明显;Cluster1在袖状胃切除术组中丰度非常低，而在假手术组中丰度较高，特别是脂化严重的区域丰度明显更高;Cluster2在袖状胃切除术组中广泛分布于全肝，而在假手术组的结果中则鲜有发现。PCA分析和UMAP降维均可以很好的区分两组小鼠肝脏的基因表达点，体现了两组小鼠肝脏之间的明显。2.4.2中的结果对UMAP降维结果的染色显示，各亚群在两组小鼠中的丰度差异明显，并与单细胞转录组学结果一致。 　　2.5.2空间转录组学肝细胞亚群通路验证 　　肝再生与发育通路的结果显示，该通路的主要基因在袖状胃切除术组小鼠肝脏中表达水平高于假手术组，并且在全肝范围内广泛存在这一表达模式;非酒精性脂肪性肝病通路的结果显示，假手术组小鼠肝脏中存在高水平的该通路中的基因表达，并且在全肝内广泛分布，而袖状胃切除术组小鼠肝脏中则仅有很低水平的表达;脂肪酸代谢通路相关的基因在假手术组中广泛存在高表达，并且这种高表达在组织学对应的脂化严重的区域内尤为突出，相比之下，袖状胃切除术组小鼠肝脏内表达水平和丰度都明显较低。qRT-PCR试验结果显示，通路分析结果中的特征基因在两组小鼠肝细胞中的表达存在明显的差异和代表性，这不仅说明两组小鼠在不同信号通路上的表达模式存在明显的差异，更说明单细胞转录组学与空间转录组学联合分析的结果中对于不同肝细胞亚群的划分和其在各组中所占的主导地位的判断是符合实际的。 　　第三部分袖状胃切除术改善肝脏代谢的机制研究 　　材料方法 　　3.1联合手术的设计与术后应激期脱离时间点的确定 　　收集20周龄饮食诱导肥胖C57BL/6N小鼠（6只）和普通饮食喂养C57BL/6N小鼠（7只）的血清和肝脏样本（肝脏肉眼观无法查见明显脂化的小鼠和肝脏存在明显病变的小鼠已被排除出实验），使用生化分析仪进行详细的肝功能检测，使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析。多聚甲醛固定肝脏组织样本并制片，进行HE染色和油红O染色。 　　对12只高脂饮食喂养的20周龄C57BL/6N小鼠随机分组并进行袖状胃切除术联合肝左外侧叶切除术（6只）和假手术联合肝左外侧叶切除术（6只）。手术开始前称重记为初始体重，每隔1天记录一次体重，直至连续3天体重波动明显减小或连续两天体重出现升高为止。记录的体重数据使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和分析。 　　3.2执行联合手术并检测术后肝再生强度的变化 　　对10只普通饮食喂养的20周龄C57BL/6N小鼠随机分组并进行袖状胃切除术（5只）和假手术（5只），同时两组小鼠都进行肝左外侧叶切除术，方法同上，按照3.1中确定的时间点对两组小鼠进行腹腔BrdU注射，48h后处死收集血清和肝脏样本。多聚甲醛固定肝脏组织并制片，应用免疫荧光染色技术和免疫组织化学染色技术对上述切片分别进行BrdU免疫荧光染色和Pcna组织化学染色，使用ImageJ软件对获取的免疫荧光染色和免疫组织化学染色结果进行分析，产生的数据使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析。 　　3.3检测手术干预后小鼠肝脏损伤情况 　　使用生化分析仪对3.2中的血清样本进行肝功能测定，使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析;对3.2中的肝脏组织切片进行HE染色。 　　3.4尝试性探讨袖状胃切除术增强肝再生的安全性 　　对袖状胃切除术组（5只）和假手术组小鼠（5只）的血清进行Olink蛋白质组学检测（96-小鼠探索系列方案），对获取的数据进行差异性分析，以热图形式表示，差异蛋白以韦恩图形式表示;应用蛋白相关性分析筛选目标蛋白，使用Western blot技术检测术后小鼠（袖状胃切除术组4只，假手术组4只）肝脏中该蛋白所在功能信号通路相关蛋白表达，并对目标分子进行合适组别小鼠肝脏切片免疫荧光染色。 　　3.5检测袖状胃切除术产生的整体性改善是否依赖于上述分子 　　设置袖状胃切除术组（SG组）、袖状胃切除术抑制剂组（SG+X组）和假手术抑制剂组小鼠（Sham+X组），选择针对上述分子合适的抑制剂对抑制剂组小鼠进行最长可接受时长的体内抑制，记录抑制期间的体重变化，处死前48h对三组小鼠进行腹腔注射BrdU标记，处死时收集血清和肝脏样本，肝脏样本拍照;应用Western blot技术检测目标分子是否被成功抑制。体重数据使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析。 　　3.6检测袖状胃切除术改善肝脏功能和增强肝脏再生是否依赖于上述分子 　　使用生化分析仪对3.6中的血清进行肝功能检测，使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析。多聚甲醛固定肝脏组织并制片，进行HE染色、Bodipy染色和BrdU免疫荧光染色，使用ImageJ软件对免疫荧光图像结果进行分析，得到的BrdU阳性率使用Graph Pad Prism 8.0.1软件进行作图和统计学分析。 　　实验结果 　　3.1联合切除手术脱离术后应激期的时间点判定 　　生化分析仪检测两组小鼠肝功能结果显示，相较于普通饮食喂养小鼠，饮食诱导肥胖小鼠的肝脏功能明显受损;HE染色和油红O染色结果显示饮食诱导肥胖小鼠的肝脏中存在大量脂化的肝细胞和脂质沉积。以上的结果预示着饮食诱导肥胖小鼠的肝脏合成能力和恢复能力都将明显弱于普通饮食喂养小鼠。饮食诱导肥胖小鼠接受联合手术后的第7天，袖状胃切除术联合肝左外侧叶切除术组小鼠的体重曲线斜率逐渐趋于零并在之后出现体重回升并与假手术联合肝左外侧叶切除术组小鼠的体重曲线斜率趋于一致，这意味着在术后第7天，接受联合手术的饮食诱导肥胖小鼠脱离了手术应激期转入合成大于消耗的恢复期。结合前述的结果，可以推断在术后第7天，接受联合手术的普通饮食喂养小鼠也将脱离手术应激期，该时间点是观察肝再生状态的最早时间点。 　　3.2袖状胃切除术直接增强肝脏再生能力 　　BrdU免疫荧光染色结果显示，袖状胃切除术联合肝左外侧叶切除术组小鼠肝脏中的肝再生强度明显高于假手术组联合肝左外侧叶切除术组小鼠的肝脏。Pcna免疫组织化学染色结果与BrdU免疫荧光染色结果显示的差异趋势相同，表现为袖状胃切除术联合肝左外侧叶切除术组小鼠肝脏中染色阳性率明显更高。 　　3.3联合切除手术组间无明显的肝脏损伤差异 　　生化分析仪检测两组小鼠血清肝功能结果显示，袖状胃切除术联合肝左外侧叶切除术组小鼠白蛋白和胆固醇水平更高，而在肝转氨酶和载脂蛋白胆固醇水平上没有明显差异，表明两组小鼠的肝损伤状态是相近的。HE染色结果并未在两组小鼠的肝脏中查见明显的肝损伤表现。以上的结果排除了两组小鼠可能存在的未知原因引起的肝损伤水平不同而造成肝再生强度不同的假阳性结果的可能。 　　3.4袖状胃切除术产生肝再生增强的安全性探讨 　　两组小鼠血清成分构成相似，但组间仍有明显差异;共有79种血清蛋白被检出，韦恩图显示袖状胃切除术组中存在3种差异蛋白;相关性分析得到的目标蛋白是Yes1，Western blot结果显示袖状胃切除术后Hippo-Yap通路整体上处在关闭状态;普通饮食喂养小鼠在接受联合手术后，Yap的免疫荧光结果显示其处在功能位，以上的结果提示Yap信号可以被袖状胃切除术放大，但在远期会被抑制。 　　3.5袖状胃切除术产生的整体性改善不依赖于Yap 　　SG组与SG+VP组小鼠的体重变化没有明显差异;与Sham+VP组小鼠相比，SG+VP组小鼠的体重明显降低，并且这种体重差异持续存在;肝脏大体观的结果显示SG组和SG+VP组小鼠肝脏脂化明显缓解，与Sham+VP组小鼠相比，色泽红润，体积较小;Western blot结果显示，维替泊芬对Yap的表达产生了明显的抑制作用。以上结果表明袖状胃切除术减轻体重、促进肝脏脂化缓解的作用不依赖于Yap。 　　3.6袖状胃切除术改善肝脏功能和增强肝脏再生不依赖于Yap 　　血清肝功能检测结果显示，SG组与SG+VP组小鼠肝功能没有明显差异，而相较于Sham+VP组小鼠则有明显的改善;HE染色结果显示SG组和SG+VP组小鼠肝脏中脂肪空泡数量和脂化肝细胞数量明显减少;Bodipy染色结果显示SG组和SG+VP组小鼠肝脏中的脂质沉积明显减轻;BrdU免疫荧光染色结果显示SG组和SG+VP组小鼠肝脏中的再生信号明显增强，以上结果在同样接受过袖状胃切除术的小鼠之间并未出现明显的差异，说明袖状胃切除术改善肝脏功能和增强肝再生的效果不依赖于Yap。 　　结论 　　1.袖状胃切除术能够有效改善非酒精性脂肪性肝病的代谢状态，在机体的整体功能、组织学和分子生物学上均有明显的体现。 　　2.袖状胃切除术能够直接增强非酒精性脂肪性肝病状态下的肝再生能力。 　　3.袖状胃切除术通过增强肝再生改善肝脏代谢状态以缓解非酒精性脂肪性肝病状态。 　　创新性和意义 　　1.本研究提出了袖状胃切除术改善非酒精性脂肪性肝病的全新机制，即能够通过增强肝脏再生恢复和改善肝脏功能，这为袖状胃切除术改善非酒精性脂肪性肝病的代谢状态提供了全新的机制理论，该理论的提出或将改变减重外科领域对袖状胃切除术机制的理解现状，为领域内的学者更好地理解该手术方式做出了重要贡献。 　　2.本研究明确鉴定袖状胃切除术后肝再生增强的效果是由手术直接产生的，而并非是手术引起的肝脂肪性变缓解的结果，这为后来在此研究方向上继续进行的后续研究奠定了扎实的基础。 　　3.本研究通过复合手术模型的设计和数学放缩逻辑排除了袖状胃切除术机制研究中脂肪肝缓解这一无关变量，为更好地研究袖状胃切除术孤立于脂肪肝缓解之外的其他机制提供了研究方法和思路。