猪囊尾蚴磷蛋白在毕赤酵母系统中的表达-论文-万方医学网

猪囊尾蚴磷蛋白在毕赤酵母系统中的表达

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摘要首先用限制性内切酶将猪囊虫磷蛋白基因（P2）从重组克隆载体pGEM-P2中切下后与相应限制性内切酶酶切的穿梭载体pPIC9K相连接,构建了重组表达载体pPIC9K-P2,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆.经测序证明,基因序列完全正确,从而大量制备重组质粒pPIC9K-P2,并用SalⅠ、BglⅡ两种内切酶分别线性化,然后分别电转化毕赤酵母菌种GS115,使重组表达载体与宿主酵母染色体发生同源整合,获得两种表型的重组菌株,分别为HIS<'+> MUT<'+>（甲醇利用快型）和HIS<'+>MUT<'S>（甲醇利用慢型）.将所在营养缺陷型选择培养基MD上生长出的转化子,采用G418抗性梯度法筛选,获得高拷贝整合菌株,PCR检测表明有目的外源基因的整合,重组菌株命名为GS115/pPIC9K-P2HIS<'+>MUT<'+>和GS115/pPIC9K-P2HIS<'+>MUT<'+>.然后对重组菌株利用甲醇进行诱导分泌表达,通过SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行分析,结果表明,磷蛋白基因在毕赤酵母中得到了成功表达,目的蛋白分子量大小为12.6KD左右,与预期的大小相吻合,而且能被抗囊虫人血抗体所识别,表达量占总蛋白的33﹪.