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摘要幽门螺杆菌(Hp)是消化性溃疡的主要病因,是胃癌及原发性胃淋巴瘤的危险因素.目前,Hp的耐药问题正日益突出,已成为根治失败的主要原因之一.甲硝唑Hp感染首次成功治疗的重要成分,也是新三联,四联治疗的主要成分.但甲硝唑的联合治疗也可能由于耐药的产生而受到限制.该文分离国内Hp临床菌株,进行耐药,敏感Hp rdxA基因的克隆,测序,并同Hp26695,J99及国外报导的菌株进行序列比较.并在此基础上选用无rdxA基因移码突变的敏感、耐药菌株,提取外膜蛋白,制备甲硝唑人工抗原、甲硝唑多克隆抗体,并用Wester Blot方法比较了敏感、耐药菌株中能与甲硝唑结合的外膜蛋白.实验方法菌株来源所有Hp菌株均分离自胃粘膜活检标本.Hp标准参考株为NCTC11637.病人胃粘膜组织匀浆后接种于含10﹪羊血的哥伦比亚琼脂平板上,在微需氧环境中37℃培养3~5d.药敏试验纸片扩散法初筛、二倍平皿烯释法确定Hp菌株对甲硝唑的耐药性.抑菌圈直径≤7mm、最小抑菌浓度(MIC)≥μg/ml判为甲硝唑耐药株.DNA制备采用常规的苯酚-氯仿法.PCR引物序列:上游5'-GGGATTTTATTGTATGCTACAA-3',下游5'-CAGGAGCATC AGATAGTTCT-3'.PCR反应总体积为100μl,内含:2.5mol/L各dNTP、250nmol/L各引物、15mol/L MgCl<,2>、2.5U Taq酶、100ng DNA模板、1×PCR缓冲液(pH8.3).PCR反应参数:94℃5min,×1;94℃30S,50℃30S,72℃60S,×10;94℃30S,50℃30S 72℃70S(以后每循环增加10S),×20;72℃10min,×1.T-A克隆及测序将扩增的目的片段克隆至pUCm-T载体中,转化于E.Coli DH 5α株并扩增,用碱变性法提取质粒,经限制性内切酶(BamH I, EcoR I)酶切鉴定后委托BBST公司测定插入片段的核苷酸序列.测序结果分析采用在Tool 5.1分子生物学软件分析上述临床菌株rdxA基因的核苷酸和氨基酸序列,并与国外报道的Hp 26695株(NC-000915)及134株Hp rdxA基因序列进行比较.菌株选择选用已行药敏试验及rdxA基因克隆、测序,无rdxA基因碱基插入、缺失的菌株.结论1.RdxA基因突变是Hp对甲硝唑耐药的重要因素.2.111a和107a菌株的碱基缺失、插入部位在文献中尚未见报道.3.成功获得甲硝唑人工抗原并制备甲硝唑多克隆抗体.4.幽门螺杆菌甲硝唑耐药可能与与转运甲硝唑的上膜蛋白减少有关.