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摘要该研究包含以下四部分内容:(一)构建人BAC-Apo(a)-Plasminogen基因簇的物理图谱:小量制备人BAC-Apo(a0-Plasminogen基因簇阳性的各BAC克隆DNA,用脉冲场凝胶电泳(PFGE)确定分子量.并通过PCR扩增对每个阳性克隆进行初步定位,选择其中最大最完整的克隆进行多种限制性内切酶分析和部分酶切定位.在8个包含该基因簇的BAC克隆中,最长的33号克隆含有一段约180kb基因片段,定位分析发现其中包含了从Apo(a)基因kringle VI type 2结构域至Plasminogen基因、类Plasminogen基因3端之间的序列,但未能覆盖Apo(a)基因的3端.所幸这并不妨碍用方法对其顺式元件进行研究.(二)通过PCR-EMSA循环快速富集调节片段及整体自身竞争EMSA:大量制备33号克隆的BAC DNA插入片段,超声打断到200bp左右,加上连接子后进行PCR扩增和标记,回收200bp的片段,作为探针对HepG2细胞核粗提物结合进行凝胶阻滞,回收阻滞带DNA,再次通过PCR标记进行新一轮EMSA和阻滞带回收,如此4次以富集可与HepG2细胞核粗提物结合的DNA调节片段.富集后的调节片段用生物素标记的引物扩增制备冷探针,重复PC-EMSA循环,EMSA体系中加入过量的冷探针进行自身竞争EMSA,以PolydIdC代替自身竞争冷探针作为对照.分别回收自身竞争及对照EMSA的阻滞带,去除其中的冷探针后用作筛选亚克隆文库的探针.富集和自身竞争的结果将在与文库杂交后显示出来.(三)亚克隆文库的构建及调节片段克隆的筛选:该研究构建的文库包含有795个单克隆,可覆盖整个BAC克隆基因簇片段大约四次.文库杂交的结果显示确有部分克隆PCR-EMSA循环富集后杂交信号增强而在自身竞争后减弱,按这个标准共挑选到32个阳性克隆.(四)调节片段的定位和功能分析该研究在已有的RERS方法基础上引进整体自身竞争EMSA和文库差示杂交技术,进一步实现了对调节元件的高通量重筛选,使基因转录调控元件数据库的构建成为可能.再结合其它方法,如基因芯片、蛋白质芯片、高通量酵母单/双杂交,高通量转染和蛋白双相电泳技术,从不同层次展开对基因表达调控细胞分化、个体发育、各种基因病发病机制、以及基因治疗研究的发展都具有重要的意义.