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摘要为了研究巴西固氮螺菌NifA活性调节的分子机制,采用定点突变(Site-directed mutagensis)技术对nifA基因进行体外突变,分别获得编码N-端18位的酪氨酸突变为苯丙氨酸(Y18F)的单突变nifA1,以及18和53位酪氨酸都突变为苯丙氨酸(Y18,53F)的双突变nifA4.将nifA1、nifA3(Y53F单突变,来自Dr.Elmerich)和nifA4分别克隆到穿梭质粒pVK100上构建重组质粒pVK1.pVK3和pVK4.这三种质粒和pKC11(pVK100-nifA,来自该实验室,作为突变nifA基因的对照),通过二亲本结合分别转入以下3种不同基因型和巴西固氮螺菌Sp7(WT,野生型)的突变株中:①Sp7358(nifA、glnB、nifH::laxZ-Km)、②Sp76061(nifA、glnB<'->、glnB编码P<,Ⅱ>蛋白,nifH::laxZ-Km)中,共得到12种转化子.通过测定报告基因laxZ的活性以检测突变后NifA的活性.在固氮条件下,分别测定含有不同质粒的12个转化子和3种受体菌的β-半乳糖苷酶活性.结果表明,Sp7358-pVK4的β-半乳糖苷酶活性分别是Sp7358-pKC11,Sp7358-pVK1和Sp7358-pVK3的2.9,1.5和1.9倍;Sp7358-pVK4的β-半乳糖苷酶活性分别是Sp76071-pKC11,Sp76071-pVK1和Sp76071-pVK3的3.6,1.6和2.1倍.为了验证突变后NifA蛋白对固氮酶活性的影响,再将pKC11,pVK1,pVK3和pVK4分别转放Sp7((nifA、glnB)、Sp7067((nifA<'->、glnB)、Sp7607(nifA、glnB<'->)3种受体菌中,得到12个转化子.在固氮条件下,用乙炔还原法分别测定12个转化子和上述3种受体菌的固氮酶活性,结果表明这些转化子的固氮酶活性与上述β-半乳糖苷酶活性的趋势基本相似.