检索历史 清除

摘要人组织激肽释放酶(human tissue kallikrein,KLKI)是激肽释放酶-激肽系统的核心成员,能裂解激肽原的特异肽键而释放激肽,并通过该系统发挥一系列的生物学功能.该研究的目的是开发人组织激肽释放酶基因工程产品,制备鉴定KLKI的试剂,并探讨用KLKI基因治疗高血压的可行性.根据国际上发表的KLKI cDNA序列,以人胰腺cDNA第一链为模板,扩增KLKI cDNA,所得的KLKI cDNA与已经发表的KLKI cDNA序列完全相同或有几个核苷酸差异.将KLKI cDNA的信号肽切除,按正确的阅读框架克隆入pGEX-4T-3载体中谷胱苷肽-S-转移酶(GST)基因的下游,用IPTG诱导实现其在大肠杆菌中的表达.Western-blotting结果显示,表达的约48kDa的融合蛋白能够被GST单抗特异性识别.以原核表达产物为抗原,分别制备了针对KLKI的多抗血清和单克隆抗体.以KLKI的重组载体注射小鼠也获得了较高效价的特异抗体.把KLKI cDNA克隆入真核表达载体pcDNA3中,通过多聚乙酸亚胺介导将真核表达重组载体转染入COS-1细胞,用所制备的抗体做间接免疫荧光反应,结果说明KLKI在真核细胞中获得了表达.通过注射此重组真核表达载体基因治疗自发性高血压大鼠(SHR),降压幅度达30mmHg,维持2周左右.将KLKI cDNA克隆入该室构建的乳腺特异性表达载体p205C3中,用获得的重组载体注射哺乳期小鼠中,乳汁中的KLKI活性高达292U/ml.这些结果表明,该试验克隆的KLKI cDNA是正确的,以原核表达产物为抗原获得的KLKI抗体为以后的研究提供了宝贵试剂.KLKI在动物细胞中的表达成功,提示了KLKI在动物体内表达的可能性.基因治疗的初步结果证明,所克隆的基因不仅能表达有活性的酶,而且重组载体具有治疗高血压的潜在价值.KLKI在小鼠乳腺中的瞬时表达证明该基因构件可用于乳腺生物反应器的研究和开发.