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摘要该课题从以下四方面对"胎盘HLA-G、C和E的分布格局在母胎免疫耐受中的作用"进行初步探究.第一部分正常和难免流产妇女早孕蜕膜免疫效应细胞分布格局采集20例正常早孕和8例难免流产妇女的蜕膜和绒膜组织,检测了生理和病理情况下蜕膜组织中NK、NKT、Mφ、T细胞各亚型和IFN-γ(Th1型)和IL-4(Th2型)细胞因子的产生细胞的分布频率;以及绒膜和蜕膜组织细胞凋亡和增殖的状态.此次实验采用CD3<'+>设门,主要检测了产生IFN-γ和IL-4的来源于CD3<'+>的T细胞和NKT细胞群体的数量,从细胞因子生成时间较早及CD56-CD3<'+>T细胞数目在两组变化不大,而CD56<'->CD3<'+>NKT细胞变化显著来看,在怀孕早期,产生IFN-γ和IL-4的CD3<'+>细胞主要是NKT细胞.结果显示,在正常人早孕成熟NKT细胞(IFN-γ生成细胞)占绝对优势,而在难免流产早孕组,以不成熟NKT细胞(IL-4生成细胞)占主导.此外,正常妊娠的绒毛和蜕膜组织中都存在细胞凋亡,滋养层细胞大量凋亡与自然流产有着密切的关系.绒毛细胞周期实验也同样表明自然流产组S/G2增殖期细胞数目少于正常组(P<0.05),提示正常早孕妇女的绒膜表现出增殖活性高于难免流产绒毛.第二部分正常和难免流产妇女KIR基因型和NK细胞同种反应性分析滋养层细胞表面父系HLA-C的存在,以及不同妇女蜕膜NK细胞受体的异质性,使得"NK细胞同种反应性"在母胎界面的作用不容忽视.在正常组,KIR单倍型A占优势,对妊娠有利,而以多种活化性KIR基因组合为特征的单倍型B在难免流产组占优势,不利于妊娠.第三部分HLA-C和HLA-G双表达载体的克隆及在LcL721.221细胞的表达为模拟母胎界面HLAⅠ类抗原的分布格局,以及探讨这种格局在母胎免疫耐受中的作用,我们用RT-PCR从孕妇绒毛膜组织有核细胞总mRNA中逆转录扩增全长HLA-C和HLA-G cDNA,首先将HLA-G经BamHⅠ和C1aⅠ双酶切,HLA-C经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,分别定向插入真核细胞双顺反子载体pVITR02的多克隆位点1(mcsl)和2(mcs2)中,然后经酶切和测序鉴定,确定已建立pVITR02的单表达质粒pVITR02-HLA-G和pVITR02-HLA-C,再将HLA-C cDNA经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,定向插入单表达质粒pVITR02-HLA-G的多克隆位点2(mcs2)中,经PCR反应初筛,再经限制性内切酶和测序分析表明已成功构建了HLA-Cw*0103和HLA-G*0101的单表达质粒pVITR02-HLA-C和pVITR02-HLA-G以及双表达质粒pVITR02-HLA-CG.第四部分胎盘HLA-G、c和E的表达格局对子宫蜕膜效应细胞功能的影响采用正常早孕和难免流产妇女蜕膜未分选的全部蜕膜细胞作为效应细胞,与第三部分构建的LcL721.221-HLA-G*0101(HLA-G*0101和HLA-E共表达)细胞、LcL721.221-HLA-C*0103(HLA-C*0103和HLA-E共表达)细胞、LcL721.221-HLA-G*0101/C*0103(HLA-G*0101、HLA-C*0103和HLA-E共表达)、及未转染LcL721.221(少量HLA-E表达)细胞共孵育15小时,研究HLA Ⅰ类分子的不同组合对蜕膜细胞的细胞毒功能、细胞亚群分布格局、Th1/Th2型细胞因子产生细胞的变化等,探索"MHC Ⅰ类分子-蜕膜细胞-NK受体"在妊娠中的作用环节和机制.