换一批
换一批摘要我们通过克隆apr-2编码区基因,获得APR-2原核表达蛋白和抗血清,为进一步对该基因的研究奠定基础.该研究进行了如下四方面实验:1.利用全反式维甲酸(ATRA)建立HL-60细胞凋亡模型,提取HL-60凋亡细胞总RNA,根据GeneBank中apr-2 cDNA编码区序列设计引物,采用RT-PCR方法获取apr-2 cDNA编码区序列,回收纯化后与PGEM-T Easy载体连接,转化大肠杆菌,构建重组克隆载体PGEM-T Easy/apr-2,进行序列分析.2.测序正确后,将目的片段亚克隆入PGEX-4T-2原核表达载体,转化大肠杆菌,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导重组融合蛋白小样表达,确定目的基因的表达情况后,进一步大量表达,利用凝胶自动扫描分析目的蛋白在细菌中的表达分布.运用电洗脱方法对获得的融合蛋白进行初步纯化.3.用获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备兔多克隆抗血清,饱和硫酸胺法纯化,酶联免疫反应(ELISA)检测抗血清滴度,运用Western-blot检测融合蛋白的免疫原性.4.全反式维甲酸培养HL-60细胞12h后,提取细胞总蛋白,利用制备的兔多克隆抗血清,对APR-2进行Western-blot检测.结论:成功地获得了细胞凋亡模型HL-60中apr-2 cDNA编码区的克隆.成功地进行APR-2的融合表达,并获得了该蛋白的兔多克隆抗血清,对该蛋白在HL-60凋亡细胞中的表达状态进行初步研究.为apr-2的功能研究及进一步阐明细胞凋亡的机制奠定基础.
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