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摘要从构建的大腹园蛛主壶腹腺cDNA文库中筛选到Avg1(基因登录号为AY302573)完整cDNA克隆,为一新的CB相关基因.CB为溶酶体内一种重要的半胱氨酸内切蛋白水解酶,具有广谱的蛋白酶活性,参与机体多种肿瘤细胞浸润转移等多种生理和病理过程,因此越来越受到人们的广泛关注.该实验根据Avg1cDNA序列特点,设计合成引物(AvgS,AvgX),提取大腹园蛛主壶腹腺总RNA并以此为模板,RT-PCR方法扩增Avg1cDNA去除信号肽的部分序列(Avg),将目的片段Avg与原核表达载体pET-28a(+),pET-20b(+)分别用EcoR I,Nco I酶切处理,回收纯化后,连接构建两个重组载体,转化克隆宿主菌Ecoli DH5a中,经酶切及PCR鉴定为阳性克隆后进一步测序鉴定,结果碱基、预测氨基酸序列均与Avg1(去除信号肽)100﹪一致,并具有正确的读码框,获得的重组质粒Avg-28a、Avg-20b可以用于下步表达.大量提取重组质粒Avg-28a、Avg-20b,将其转化到表达宿主菌Ecoli BL21(DE3)中,鉴定为阳性克隆后,用IPTG 37℃诱导表达,SDS-PAGE电泳分析,Avg-28a-DE3在近36kDa处出现了明显的表达带,其大小与预计分子量(35459.13Da)相当,经薄层扫描表达外源蛋白量占全菌体蛋白总量的39.6﹪,且表达形式主要为包涵体,将表达的包涵体蛋白进行变性、复性处理后测定蛋白酶活性,未见明显的酶活性;而Avg-20b-DE3未出现明显的表达带,用RT-PCR方法检测到了Avg mRNA的转录.将Avg-20b-DE3诱导,超声波破菌后上清液测定蛋白酶活性,显示了明显的酶活性.制备包涵体蛋白,电洗脱纯化后,常规方法免疫吉戎獭兔,结束后颈动脉采血,经ELISA检测,呈明显的阳性反应.Western blot在36kDa处显示了特异蛋白结合带,Avg原核表达蛋白能够有效地刺激机体产生抗体,具有良好的免疫原性,为CB的进一步应用研究奠定了基础.