检索历史 清除

摘要该课题的目的是从该室已经制备的抗人血小板GPⅡb/Ⅲa单克隆抗体中筛选出与血小板特异性结合最强且抑制血小板聚集最显著的一种抗体P140,进行人源化改构,在保留鼠源可变区的同时,引入人源恒定区,制备抗人血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的人-鼠嵌合抗体.以期成为用于临床治疗心脑血管疾病以及预防PCI术后"再狭窄"的有效药物.通过间接免疫荧光试验和血小板聚集抑制试验,选取单克隆抗体P140,并从该抗体的杂交瘤细胞株(P140)中提取总RNA,通过反转录PCR得到抗体轻链基因和重链Fd段基因,以特定位点分别插入噬菌体抗体表达载体p3MH上,构建原核表达重组质粒p3MH/P140 κ-Fd,并在XLI-Blue菌中进行了原核表达.ELISA鉴定结果表明,表达上清中含有可溶性Fab抗体,并且能特异性地识别人血小板.进而对表达产物进行了亲合层析纯化.SDS-PAGE蛋白电泳、ELISA和Western blot的检测结果证明,P140Fab抗体的分子量约47kD,是鼠源性的Fab抗体,与人血小板能特异性结合,体外ADP诱导的血小板聚集试验证明,P140Fab抗体能明显抑制血小板的聚集,并且具有剂量抑制效应.用RACE(cDNA末端的快速扩增)的方法,获得了完整的P140抗体重、轻链可变区基因,分别连接于带有前导序列的真核表达载体VH、V κ上,分别构建了重、轻链嵌合抗体的真核表达载体VH/CP140和V κ/CP140,共转染到CHO细胞中,进行瞬时表达.RT-PCR和ELISA检测证明,转染后宿主细胞有人-鼠嵌合抗体基因的转录,表达上清中含有人-鼠嵌合抗体CP140.随后将包括前导序列在内的鼠单抗P140可变区基因分别连接于不含前导序列真核表达载体PWS3上,构建真核重组表达载体PWS3-P140,转染CHO细胞,ELISA检测结果证明,表达上清中含有能与血小板特异性结合的人-鼠嵌和抗体,而且表达量明显提高.结论:成功研制了一种新的功能性抗人血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的Fab抗体(P140Fab);成功构建了抗人血小板嵌合抗体的真核表达载体并在CHO细胞中表达了一种新的特异性抗人血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的人-鼠嵌合抗体(CP140).