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摘要第一部分:人胚脑神经干细胞的分离培养、克隆和分化 目的:探讨从人胚中脑组织中分离培养的神经干细胞在克隆增殖和分化方面的生物学特点.方法:采用无血清培养技术将3-4月龄人胚中脑组织制备成单细胞悬液,接种到含有表皮生长因子(Epidermal Growth Factor,EGF)、碱性成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor-basic,bFGF)和白血病抑制因子(Leukemia Inhibitory Factor,LIF)的DMEM/F12(1:1)加B27(B27 Supplement)的无血清培养液中培养,待形成原代克隆球后,用有限稀释法进行单细胞克隆和传代扩增,以获得大量的来源于同一细胞的亚细胞系神经干细胞克隆球.一部分神经球进行5-溴-2-脱氧尿苷(5-Bromo-2-deoxy-Uridine,BrdU)标记及其免疫荧光检测和神经上皮干细胞蛋白(Neuroepithelial StemProteins,Nestin)免疫荧光检测.另一部分神经球用含有10%胎牛血清的培养液诱导分化,3周后分别进行神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞特异性标记物微管相关蛋白-2(Microtubule Associated Proteins-2,MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)和2,3-环核苷酸磷酸二酯酶(2',3'-Cyclic Nucleotide3'-Phosphodiesterase,CNP)的免疫荧光检测.结论:从人胚中脑组织中分离得到的细胞具有不断增殖和自我更新能力,并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的多分化潜能,是中枢神经系统的干细胞.第二部分体外人神经干细胞向多巴胺神经元的定向分化 目的:探讨体外神经干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元的方法.方法:取3块24孔培养板的70个孔接种人神经干细胞克隆球,分为5组,每组14孔,加入不同的分化培养液:对照组加入含10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)的分化培养液;IL-1α组加入含白细胞介素-1α(Interleukin-1α,IL-1α)的10%FBS分化培养液;联合因子组加入含IL-1α+白细胞介素11(Interleukin-11,IL-11)+LIF+胶质细胞源性神经营养因子(Glial Cell Derived Neurotrophic Factor,GDNF)的10%FBS分化培养液;纹状体培养液组加入含IL-1α+纹状体细胞培养液的10%FBS分化培养液;银杏内酯组加入含IL-1α+银杏内酯的10%FBS分化培养液.在饱和湿度的37℃、5%CO2培养箱中分化3周后,取每组的前8孔,用免疫荧光检测各组分化细胞中多巴胺神经元特异性标志物酪氨酸羟化酶(Tyrosine Hydroxylase,TH)的表达,并对TH阳性神经元的数量、分化率、胞体面积和细胞周长进行图象处理.取每组的后6孔,进行TH和微管相关蛋白-2(MicrotubuleAssociated Proteins-2,MAP-2)免疫荧光双标检测,计算各组双标神经元占MAP-2阳性神经元的百分比.用STATA7.0统计软件进行方差分析和两两比较.结论:IL-1α具有明显诱导人胚中脑神经干细胞向多巴胺能神经元定向分化的作用;IL-11、LIF、GDNF和IL-1α联合使用对神经干细胞向成熟的多巴胺能神经元分化起协同作用;胚脑纹状体细胞培养液对多巴胺能神经元的成熟具有促进作用;银杏内酯无明显的诱导神经干细胞向多巴胺能神经元分化的作用,但对多巴胺能神经元的成熟尤其是突起的发育具有明显促进作用.