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摘要本实验的目的在于观察实验室诱导的耐药H.pylori各靶基因(23S rRNA和pbps)突变形成情况,探讨基因突变与H. pylori耐药形成的关系;此外,还运用蛋白质组学技术,比较了AMO耐药菌株和敏感菌株的蛋白谱,以期为进一步筛选与H.pylori耐药相关的蛋白提供线索.首先以H.pylori 26695为出发菌株,采用连续传代法,分别在含有CLR和AMO的抗性平皿上选择耐药突变体;经PCR分段叠加扩增23S rRNA基因片段和各PBPs全基因(HP0597、HP1565、HP1542、HP1556和HP0160),利用变性高效液相色谱技术(DHPLC)测定出发菌株和耐药菌株靶序列中的点突变,并用测序法验证;采用三氯醋酸/丙酮沉淀法提取出发菌株和AMO耐药菌株全菌蛋白,通过双向凝胶电泳(2-DE)分离蛋白,银染后应用2D-Image Master软件比较AMO耐药菌株和敏感菌株的蛋白表达谱,对部分表达差异的蛋白点进行胶内酶解,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)进行鉴定,根据各肽段的质/核比数据,利用MS-FIT program,在NCBI的H.pylori蛋白数据库中搜索理论上酶解肽段能与之相匹配的蛋白.一、CLR耐药机制研究结果.经过在CLR抗性平皿上连续传代,分别得到了两株低浓度耐药菌(low-CLR<'r>-1和low-CLR<'r>-2),MIC为10和8μg/ml.在此基础上,又获得了两株MIC为32μg/ml的耐药菌CLR<'r>-1和CLR<'r>-2.二、AMO耐药机制研究结果.通过体外诱导获得MIC为8μg/ml的耐药菌1株(AMO<'r>),其耐药表型经-80℃冻存和在不含AMO的培养基上多次传代后会丧失.在DHPLC WAVEMaker软件预测的待测序列部分变性温度及±1℃3个温度下,全部待测序列的保留时间和色谱峰形与相应的出发菌株H.pylori 26695的靶序列完全相同;测序结果亦显示:耐药菌株和出发菌株的待测序列相同,未检出基因点突变等结构变异.结论:23S rRNA点突变A2143G是H.pylori的CLR耐药性形成过程中的晚期事件,是我国H.pylori CLR耐药形成的主要机制;H.pylori AMO耐药性形成主要是一种不稳定的表型变化,可能与相关基因的表达变异有关.