检索历史 清除

摘要本文首先建立了毛细管电色谱拆分手性DL-硝基精氨酸的方法.研究选用毛细管电色谱(Capillary electrochromatography,CEC)这种新型的分离技术,通过对手性选择配体、pH和有机改性剂浓度等多个影响因素的考察,建立了手性配体交换法分离检测生物样品中D-NNA和L-NNA的成熟方法.本研究随后考察了肾动、静脉结扎后,大鼠体内D-NNA的升压反应和手性转化.结合D型氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase, DAAO)在体内的分布特点和底物特点,本文提出D-NNA在肾脏DAAO作用下氧化脱氨生成α-酮酸,而后α-酮酸在转氨酶参与下,通过立体选择性获取氨基生成L-NNA,实现手性转化.随后实验发现DAAO抑制剂苯甲酸钠(400 mg/kg)可阻断大鼠对D-NNA的升压反应,但不影响大鼠对D-NNA/肾匀浆孵育液的升压反应.同时体内各组织匀浆的DAAO活性、代谢D-NNA能力和L-NNA转化量三者间成高度正相关(r > 0.92).体外DAAO蛋白可以代谢D-NNA而不生成L-NNA,但可使肾和肝匀浆中的D-NNA手性转化率显著增高.鉴于氨基酸手性转化现象具有一定的普遍性,本实验进一步考察了DAAO的底物选择性和手性转化率之间的关系.利用DAAO抑制剂苯甲酸钠,实验考察了D-NNA的手性转化和硝基精氨酸体内代谢动力学的立体选择性之间的关系.研究更进一步考察了D-NNA/DAAO酶液孵育液在预先给予苯甲酸钠大鼠体内的升压活性和手性转化情况,结果证实孵育液中的α-酮酸可以在大鼠DAAO活性被抑制的情况下,转化生成L-NNA并引起大鼠血压升高.另一方面,D-NNA与正常小鼠(ddY/DAO<'+>)的肾匀浆孵育则可实现D-NNA的手性转化,但DAAO活性缺失(ddY/DAO<'->)小鼠的肾匀浆均不具有DAAO活性,因而不能使D-NNA代谢进而转化生成L-NNA,但是当ddY/DAO<'->小鼠肾匀浆外加一定量的DAAO蛋白后,同样可以实现D-NNA的手性转化,这个结果就表明了DAAO在D-NNA的手性转化过程中是不可或缺的.通过多方面的试验,本文提出D-NNA手性转化的两步反应机制,并首次证实D-NNA在DAAO催化下生成α-酮酸是其实现手性转化的第一步,而且D-氨基酸在DAAO催化下的氧化作用是其体内发生手性转化的前提条件,同时研究证实硝基精氨酸在体内代谢立体选择差异主要源于D-NNA在DAAO催化下的氧化和手性转化.