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摘要狂犬病是一种通过动物传染的自然疫源性传染病,其致死率为100％,接种狂犬病疫苗是控制狂犬病流行的唯一有效手段.Vero细胞是WHO推荐使用的人用疫苗生产基质.目前国内Vero细胞制备狂犬病疫苗均采用转瓶生产工艺,由于受到转瓶表面积和培养条件的限制,生产细胞密度低,劳动强度大,操作过程易污染,疫苗质量难以得到保证.自从60年代微载体生物反应器培养技术建立以来,国外许多国家对其在疫苗生产中的应用进行了广泛研究,国内亦有多家研究机构对贴壁依赖性细胞用生物反应器分批式培养(bach)、流加式培养(Fed-batch culture)、半连续式培养(semi-continuous feeding culture)和灌注式培养(Perfusion culture)等方法培养进行了多项研究,但很少将灌注培养方法全面用于疫苗生产.灌注培养是一方面新鲜培养基不断加入反应器,另一方面又将反应器液体不断取出,但细胞始终留在反应器内、处于不断的营养状态下.通过调节灌注速度,补充细胞足够的营养,去除有毒的代谢产物,可以使培养环境相对稳定,培养过程始终保持在稳定的、代谢废物低于抑制水平的状态.不仅大大提高了细胞生长密度而且有助于产物的纯化.我们对搅拌式生物反应器灌注培养技术应用于狂犬病疫苗生产作了进一步研究,取得了很好的效果.将预先用含牛血清的培养液浸泡24小时的微载体与仅经过常规水化处理的微载体的细胞贴壁情况进行比较,结果显示浸泡可增加微载体对细胞的吸附能力,但对细胞贴壁的整体结果影响不大.经培养液浸泡的微载体在120分钟内细胞贴壁率明显高于后者,随着时间延长,4小时后二者细胞贴壁率基本一致.而生物反应器搅拌速度则对细胞贴附影响较大,搅拌速度设为50rpm左右,细胞贴壁率较高,4小时内达80％以上;搅拌速度设为150rpm时,细胞几乎难以贴附微载体.在反应器培养试验中,分别用1×10<'4>/mL、1×10<'5>/mL和1×10<'6>/mL的细胞浓度接种反应器,发现细胞在接种6小时后,90％细胞贴附上微载体;1×10<'5>mL接种浓度的第7天细胞密度达6-7×10<'6>/mL,细胞状态稳定,维持时间长;而接种浓度为1×10<'4>/mL的12天细胞密度才能达到高峰;接种1×10<'6>/mL浓度的3天细胞密度即达高峰,但细胞老化快,有明显较多细胞脱落的现象.用1×10<'5>/mL细胞密度接种反应器,于第7天细胞密度达6×10<'6>/mL左右时接种病毒.试验将病毒感染复数分别设为0.01MOI和0.001MOI,取样测定毒力发现,毒力高峰出现在3-7天,以后逐渐下降.两种感染复数的毒力差别不显著,0.01MOI的毒力整体水平略高于0.001MOI,并且毒力高峰较早于后者.在反应器培养过程中,对葡萄糖消耗量、乳酸产生量和氨的产生量进行监测,发现在细胞培养初期,葡萄糖消耗量、乳酸产生量和氨的产生量都很低,随着细胞增殖速度加快,三者基本上是随细胞数量的增加而增加;接种病毒后,由于细胞感染病毒代谢水平降低,葡萄糖消耗和乳酸的产生在经历一个短暂降低过程后,保持较低水平,呈平台期维持,氨的产生量则波动不大.反应器灌注量依据培养液中葡萄糖残余量进行调整,细胞增殖培养过程中,随着细胞数量的增大,葡萄糖消耗量增加,灌注速度加快;接种病毒后,由于细胞被感染和部分老化脱落,代谢速度减缓,结合参考病毒增殖规律,需逐步降低灌注速度.灌注体积为每天0-3个工作体积,一般整个细胞培养过程灌注约8个工作体积.接种病毒后,调节灌注速度和收获速度,总共可收获18个工作体积左右的病毒液.本项实验显示,5L生物反应器细胞接种量在10<'5>/mL左右时,细胞生长6-7天后密度可达6×10<'6>/mL,以0.01MOI感染病毒,连续12天收获病毒液,其毒力仍在6.0logLD<,50>/mL以上.试制的2批疫苗中,连续收获病毒原液11-12天,经浓缩、灭活、离心等处理,再进一步用分子筛提纯,疫苗成品效价分别为5.63IU/mL和4.89IU/mL,残余牛血清蛋白含量小于50ng/mL,Vero细胞DNA含量小于10ng/mL,各项检定指标均符合《中国生物制品规程》2000年版要求.本文研究的狂犬病疫苗生产工艺,不仅采用灌注法高密度培养细胞,在病毒繁殖过程中仍采用灌注方法.通过调节灌注流量,不仅在细胞增殖时稳定培养环境,而且在接种病毒后细胞仍能得到足够的营养和平衡的环境;同时使反应器中病毒浓度得到调节,利于病毒繁殖.研究表明,生物反应器灌注培养法可用于Vero细胞狂犬病疫苗的生产.由于生物反应器不仅提供了有利于细胞生长的稳定的PH环境,营养均匀充足,而且乳酸和氨等有毒代谢产物得以不断排除,因此细胞维持时间长,有利于病毒的持续繁殖.此外该方法生产疫苗所需人员和GMP生产车间面积大大低于转瓶工艺的疫苗生产,可极大地降低疫苗生产成本,因此该研究的小试工艺具进一步放大生产的可行性.