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巴西固氮螺菌与吲哚乙酸(IAA)合成有关基因的克隆及功能分析

摘要巴西固氮螺菌(Azospirillumbrasilense)是一种能够促进草类和谷物生长的,具有固氮能力的根际促生长细菌。A.brasilenseYu62从北京郊区的玉米根际分离获得,在添加了色氨酸的培养基中能够合成超过50μg/ml的吲哚-3-乙酸(IAA)。为了更清楚的了解A.brasilense产IAA的合成机理,我们通过Tn5转座子诱变的方法获得了5,000多株具有卡那抗性的接合突变株,将这5,000多株突变株分别接种在MAZ培养基中摇瓶培养,用比色法和HPLC方法测定菌液中的IAA含量,得到了5个IAA产量降低的突变株。以转座子内的luxAB基因为探针进行Southern杂交,结果每个突变株都只有一条杂交带,证明这5个突变株都是Tn5单拷贝插入的突变体。测序及同源性比较表明,在这5个IAA产量降低的突变株中,被插入失活的基因分别为编码GntR家族的转录调节因子的atrA基因、编码ABC型Fe3+转移系统中的离子结合蛋白ftsA基因、编码外膜蛋白的omaA基因,编码醛脱氢酶的aldA基因及编码邻氨基苯甲酸合成酶组分Ⅰ的trpE基因。互补实验表明携带atrA、ftsA和omaA基因的广宿主载体可以不同程度的恢复相应突变株的IAA产量。另外还克隆了atrA下游的atrB和atrC基因,它们分别编码磷酸转移酶和氨基转移酶,atrA、artB和artC共同组成了一个基因簇,推测此基因簇参与催化吲哚丙酮酸途径中由色氨酸脱氨基生成吲哚丙酮酸的酶促反应。通过同源重组的方法分别获得了artB和artC基因的卡那霉素抗性基因插入突变株,分析突变株的IAA产量发现,atrB基因失活后,IAA产量不变;当atrC基因失活后,IAA产量比atrA基因突变株的产量还要低。

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