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摘要本论文分两部分；第一部分为γδT细胞抗原识别机制的研究。γδT细胞认为是天然免疫和获得性免疫之间的桥梁，广泛地参与到抗感染免疫、肿瘤免疫和自身免疫等各个方面。但迄今为止，只有少数的γδT细胞受体(Tcellreceptor，TCR)所识别的配体被鉴定，γδTCR抗原识别的具体细节尚不清楚。对三种抗原受体的结构和序列多样性的研究结果提示，αβTCR、γδTCR和抗体的识别抗原特异性主要决定于其互补决定区(complementaritydeterminingregions，CDRs)；γδTCR在抗原识别上与αβTCR相差甚多而与抗体更类似，被认为是以“抗体类似”的方式与抗原结合。γδTCR和抗体整体结构比较以及δ链和抗体重链的CDR3长度和氨基酸多样性的比较提示，γδTCR的δ链和抗体重链在识别抗原中的作用类似；CDR3δ是γδTCR与抗原结合的重要部位。 本课题组的前期工作证明，来源于卵巢癌的γδ肿瘤浸润淋巴细胞(tumorinfiltratinglymphocytes，TIL)δ链CDR3短肽OT3能特异性地结合肿瘤组织、肿瘤细胞系及其蛋白提取物和应激分子。 为了进一步阐明γδTCR抗原识别的机制，本研究利用PCR搭桥技术，将抗体重链CDR3区用被OT3短肽的相应基因序列来替换，构建成嵌合抗体重链的重组基因片段，克隆到表达载体pHγ1中，转染到真核细胞中进行表达；筛选并大量培养阳性表达细胞以获得含γδTCRCDR3δ的嵌合抗体。利用流式细胞、激光共聚焦显微镜和表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance，SPR)等技术对嵌合抗体的抗原结合特异性进行了研究，比较嵌合抗体与合成的OT3短肽在抗原识别特异性方面的差别，以阐明γδTCR抗原识别的机制及其结构基础。结果表明，含γδTCRCDR3δ的嵌合抗体可以与人卵巢癌细胞系SKOV3、HO8910和Hela等细胞及其蛋白提取物结合，与其他人类肿瘤细胞系及其蛋白提取物不结合或结合较弱，提示嵌合抗体的抗原结合性有不很严格的组织特异性，并有一定的肿瘤结合特异性。SPR的结果表明，嵌合抗体可与热休克蛋白60(Heatshockprotein，HSP)发生特异性结合。 同时，本研究结果表明含γδTCRδ链CDR3区(OT3)序列的嵌合抗体与合成的OT3肽在抗原识别特异性方面是一致的，而对应激分子HSP60的结合强度比OT3肽要强。将OT3短肽替换了抗体重链的CDR3区之后，嵌合抗体的抗原结合特异性是由OT3所决定的，从而证明了γδTCR的抗原识别是一种线性的识别，CDR3δ区决定了其抗原识别的特异性。本研究的结果对于阐明γδTCR抗原识别机制提供直接的实验依据，对于进一步理解γδT细胞在免疫系统中的作用和地位具有重要的意义。论文的第二部分为应用合成重叠肽库进行SARS-CovB细胞抗原表位的筛选和鉴定。严重急性呼吸道综合症(SevererAcuteRespiratorySyndrome，SARS)是本世纪出现的第一次严重的传染性疾病，该疾病的特点(高传染性和高死亡率)使它成为一种对全球公共健康的特殊威胁。在SARS爆发期过后，所有的国家都必须对SARS的再度出现保持警惕，而且要保持快速检测和应对SARS卷土重来的能力。因此，开发一种有效的SARS疫苗或抗病毒药物是十分必要的。本研究利用SARS恢复期病人的血清和包含SARS相关冠状病毒(SARSassociatedcoronavirus，SARS-Cov)蛋白的合成重叠肽库，对SARS-CovB细胞表位并进行筛选和鉴定。 首先，我们根据SARS-CovBJ01毒株的核酸序列，合成了覆盖SARS-Cov突刺蛋白(Spikeprotein，S蛋白)、膜蛋白(Membraneprotein，M蛋白)、外套膜蛋白(Envelopprotein，E蛋白)、核蛋白体蛋白(Nucleocapsidprotein，N蛋白)10肽的重叠肽库，用酶联免疫吸附分析(Enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA)法筛选与SARS恢复期病人的血清反应的表位。在此基础上重新设计、合成含多个表位的短肽并进行交叉反应性检测。对所得到的高交叉反应性的阳性表位进行了竞争结合实验。并制备了抗阳性候选表位的多克隆抗体，验证该抗体与各候选表位肽以及SARS-Cov裂解物的结合和竞争结合能力。结果表明，经过第一轮筛选，共有¨1条多肽与SARS恢复期病人的血清反应，分布在S蛋白(99条)，N蛋白(9条)，M蛋白(2条)和E蛋白(1条)。重新设计、合成的23条多表位肽对42份病人血清的反应结果显示，S471-503、S602-625、S1164-1191、N67-76和N367-389肽分别与30份、30份、28份、38份和32份SARS病人血清反应。竞争结合实验结果证明，游离的肽能够抑制病人血清与相应多表位合成肽的结合，并且也可以抑制病人血清与SARS-Cov裂解物的结合。制备的抗上述阳性候选表位肽的多克隆抗体可以与SARS-Cov裂解物结合，并且这种结合也可以被相应的肽所抑制。其中S471-503能抑制SARS-Cov的受体血管张力素转化酶(Angiotensin-convertingenzyme2，ACE2)与其受体结合区域(receptorbindingdomain，RBD)的结合，并在体外抑制SARS-Cov对Vero细胞的感染。 为了最大可能的筛选到SARS-Cov的B细胞表位，本研究应用包含SARS-Cov主要结构蛋白的合成重叠肽库，进行最精确的B细胞表位作图，并根据表位作图的结果重新组合、设计了多表位肽，进行了交叉反应性测试。共得到了5条高交叉反应性的肽，其中S471-503对SARS-Cov感染Vero细胞有抑制作用。上述结果为开发治疗性和预防性疫苗、诊断性试剂，以及阻断病毒-细胞融合的抗SARS-Cov药物奠定了基础。该部分研究结果所形成的论文已经被“JournalofCombinedChemistry”杂志所接受。