检索历史 清除

摘要优势密码子与基因表达效率之间的关系已经在单细胞和多细胞生物中得到了实验证明。对大肠杆菌和酵母两种单细胞生物密码子偏性的研究表明，它们偏爱使用的密码子与细胞内含量最丰富的同工tRNA相对应，这样不仅能够提高翻译效率还有利于保证翻译的忠实性。在线虫和果蝇等较为简单的多细胞生物中，也发现优势密码子所对应的同工tRNA具有较高的含量和转录水平。体外表达研究表明，采用哺乳动物细胞偏爱的密码子对外源目的基因进行改造有助于提高表达水平。病毒作为一种没有细胞结构的寄生生物，其基因表达依赖于宿主细胞的表达系统。然而研究表明，许多哺乳动物病毒与宿主细胞具有明显不同的密码子偏性，提示病毒密码子偏性可能是病毒与宿主细胞相互作用的重要调控因素。研究病毒密码子偏性在与宿主细胞相互影响中的作用，对病毒的进化，病毒与宿主细胞相互作用的机理，以及提高外源基因在病毒载体中的表达水平都可能具有重要的意义。本论文选择在哺乳动物细胞浆内复制、密码子偏性明显与宿主细胞不同的痘苗病毒为研究对象，研究了密码子偏性与痘苗病毒载体表达效率之间的关系。 分别按痘苗病毒的优势密码子和人的优势密码子对HIV-1gag，nef,rev，tat基因以及绿色荧光蛋白基因进行改造。利用改造前后的目的基因构建了共15株重组痘苗病毒(其中包括一株对照病毒)。借助PCR及其产物测序对重组痘苗病毒进行鉴定。采用免疫荧光、Westernblot和流式细胞仪分析比较了改造前后目的基因在痘苗病毒载体中的表达水平。还采用荧光分析和流式细胞仪检测比较了密码子偏性不同的绿色荧光蛋白基因在传统质粒DNA载体pcDNA3(在胞核内转录目的基因)和基于SFV的质粒DNA载体pSCA(在胞浆内转录目的基因)中的表达水平。结果显示：一、按上述两种方式改造的目的基因之间，密码子偏性出现了很大的差别，一类基因全部采用人的优势密码子，G+C含量最高达68.4％；而另一类基因全部采用痘苗病毒的优势密码子，A+T含量最高达73.1％，使用的几乎全是人的劣势密码子。二、痘苗病毒载体中的表达分析结果显示，密码子改造前后的14个基因都可以在痘苗病毒载体中有效表达，密码子偏性(G+C含量最高达68.4％，A+T含量最高达73.1％)不会对表达效率产生较大的影响。三、pcDNA3质粒载体的表达分析结果显示，全部使用人优势密码子的绿色荧光蛋白基因(EGFP基因，G+C含量为61.8％)与部分使用人优势密码子的绿色荧光蛋白基因(GFP基因，G+C含量为51.5％)都能够有效表达，全部采用痘苗病毒优势密码子的绿色荧光蛋白基因(VGFP基因，A+T含量为73.1％)表达水平很低。四、在pSCA质粒载体及其适宜的宿主细胞(BHK21)中，上述三种不同密码子使用偏性的绿色荧光蛋白基因均可有效表达，且具有相近的表达水平。 上述结果表明，采用人优势密码子合成的目的基因、采用痘苗病毒优势密码子合成的目的基因，以及使用较多同义密码子的野生型基因都能够在痘苗病毒载体中有效表达，高G+C含量与高A+T含量不会对痘苗病毒载体表达效率产生较大的影响。我们称之为痘苗病毒载体对目的基因密码子使用的宽容性。使用pcDNA3和pSCA质粒表达系统的研究结果提示，痘苗病毒载体的这种特性与其在胞浆内转录有关，可能因为胞浆转录产物无需出核转运即可直接进入翻译过程，不会受富含A+U转录产物中潜在抑制性序列(INS)等因素的影响，但确切的机理尚待深入研究。综合以往的和本研究的结果，我们认为密码子偏性从狭义上讲是充分利用丰富的同工tRNA，提高翻译效率和翻译的忠实性，从广义上讲尚涉及转录效率、转录产物的修饰与转运，转录产物的稳定性与降解等。本研究为痘苗病毒载体和常用真核表达载体的选择使用提供了重要的实验依据。