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摘要普通型胃腺癌伴神经内分泌(neuroendocrine，NE)分化，是指胃腺癌中有分化的神经内分泌细胞，但其数目在癌组织成分中所占的比例较小不足50％，且以单个细胞或细胞巢的形式分散存在，是弥漫神经内分泌系统的一部分。我们以往研究发现前列腺癌伴散在NE细胞分化约占38.1％，大肠癌和乳腺癌分别为41.5％和21％，且高分化癌NE细胞的发现率明显高于低分化癌。而普通型胃腺癌中，NE细胞分化约占39.6％，低分化腺癌明显高于高分化腺癌。这些差异是否与肿瘤所在部位的胚胎起源、肿瘤病因学、组织发生学的不同及遗传学改变有关，仍处于探索研究阶段。 与神经内分泌肿瘤相比，非神经内分泌肿瘤中NE细胞研究较少，特别是用分子遗传学方法研究普通型胃腺癌中单个NE细胞的起源方面尚未见报道。关于普通腺癌伴NE分化的发生机制存在许多不同的假说。目前多数人认为NE细胞和上皮细胞均来源于内胚层多潜能干细胞。在肿瘤发生及演进过程中，内胚层的多能干细胞受激素、局部微环境及基因组不稳定性的影响，使某些被抑制的基因组密码发生随机脱抑制，在RNA翻译水平选择性的激活两种以上的调节基因产生双向或多向分化。然而，这些推测仅建立在形态学的观察及体外实验的基础上，缺乏可靠性和再现性；且不同肿瘤组织中散在的NE细胞不论在形态上还是对肿瘤组织的生物学行为的影响上都存在很大区别，究竟散在的神经内分泌细胞是否存在染色体及相关基因水平的改变，它们是否为肿瘤的一种成分，尚不清楚。因此，我们对伴神经内分泌分化的普通型胃腺癌进行分子水平的研究，以期明确NE细胞的克隆性起源，对这一类型的胃肠道肿瘤做出新的评价。 激光显微切割技术的出现，使得我们能够从胃腺癌中获取单个散在的NE细胞。全基因组扩增技术是一项以微量(ng级)DNA为模板，通过Phi29DNA聚合酶强大的结合能力及3’-5’外切酶活性对全基因组进行高保真性地连续扩增，从而得到大量(μg级)基因组DNA的新技术，它弥补了模板量不足的问题。联合激光显微切割及全基因组放大，获取腺癌中NE细胞，提取DNA并与腺癌细胞进行分子水平改变的比较，在全基因组范围内寻找复制差异片段，推测其克隆起源。 干细胞在分化过程中，染色体有丝分裂不均衡，可造成部分基因在两种分化的细胞中同时出现等位基因的改变(增益、丢失或突变)，此原理可以通过微卫星改变(包括微卫星不稳定和杂合性丢失)及突变、CGH等方法推断组织细胞的克隆性起源。微卫星不稳定及杂合性丢失已成为较成熟的推断肿瘤起源的方法，它具有敏感性强的特点，但由于各实验室选择微卫星位点的差异较大，尚缺乏特异性。基因的突变同样可以推测肿瘤起源，具有较高的特异性但敏感性不强。联合微卫星和突变的检测可以使推理结果更准确。 材料和方法本实验收集浙江省人民医院2001-2003年间125例普通型胃腺癌及癌周正常胃粘膜新鲜标本。首先利用冰冻切片-嗜铬粒蛋白A(ChromograninA，CgA)单克隆抗体免疫组化筛选含NE细胞较多的胃腺癌组织及相应正常对照组织，然后经激光显微切割获取200个左右单个NE细胞、100个左右腺癌癌巢及正常腺体，切割后样本采用DNAMicro-kit抽提试剂盒及Repli-g扩增试剂盒进行抽提和全基因组放大，其次在全基因组范围内选取39个微卫星位点进行PCR-SSLP分析及通过PCR-测序检测p53突变发生情况，最后比较胃腺癌内散在的NE细胞与腺癌细胞微卫星改变和p53突变的一致性情况，推测NE细胞的克隆起源。 结果1.免疫组化-激光显微切割结果：在125例胃腺癌中，中-大量NE细胞占28.8％(36/125)；在对应病例的正常对照胃粘膜中占29.8％(39/121)。其中，胃腺癌及正常胃粘膜中均有中-大量NE细胞的有14例，占11.2％。6例NE细胞含量最多而进行激光显微切割，在150倍物镜下捕获腺癌及正常腺体中单个NE细胞各200个左右，20倍物镜下捕获无NE细胞的腺癌癌巢组织及正常腺体100个左右。 2.微卫星分析结果：从微卫星改变上看，各样本MSI发生率高于LOH。从不同细胞微卫星改变发生率上比较，腺癌细胞高于NE细胞。从各位点所在染色体上看，LOH多发生于4q、5q、11p、17p，位点附近为胃肠道常见肿瘤相关基因，而MSI多发生于7p、8p、12q、13q、18q。从两种细胞LOH及MSI一致性上看，例6LOH在NE细胞及腺癌细胞中一致性最高，不一致性最低。例5MSI在NE细胞及腺癌细胞中一致性最高，不一致性最低。例2未发生一致性LOH而不一致改变的位点较多。各样本LOH及MSI改变一致性程度从高到低为：例6＞例5＞例4＞例3＞例1＞例2。 3.p53基因外显子5-8突变结果：6例样本中，胃腺癌细胞外显子7、外显子8及内含子7各有1例发生突变，突变频率为50％，而6例样本中NE细胞各1例发生外显子7及内含子7突变，突变频率为33.3％。序列分析结果显示，外显子7为第244位密码子突变，内含子7为23222位点突变，而外显子8为第273位密码子突变。外显子7及内含子7在两例样本(例4、例5)的腺癌细胞及NE细胞中均发生一致位点及类型的突变，这些患者临床病理组织学类型均为低分化癌，TNM分期为ⅢA期。外显子8仅在一例样本(例1)的腺癌中检测到突变，而其他几例均未检测到突变。 4.微卫星与p53突变结果分析：我们认为6例伴NE分化的普通型胃腺癌中，4例NE细胞与腺癌细胞起源于同一干细胞，NE细胞作为肿瘤成分，本身具恶性且分泌激素促进肿瘤生长。2例则不同起源，推测NE细胞可能仅作为肿瘤间质成分，受环境因素的影响而出现部分遗传学改变，但有待于增加样本量以进一步研究证实。 结论首次发现普通型胃腺癌中散在的神经内分泌细胞可能具有遗传异源性。