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摘要第一部分p53-HDM2相互作用的非肽小分子抑制剂syl-155对肿瘤细胞的毒性作用 p53是一个强力抗肿瘤活性的抑癌蛋白。在许多人类肿瘤，p53被失活，有多种机制参与失活p53。其中一个机制是癌蛋白MDM2(在人为HDM2)与之结合，并将其降解。在p53和MDM2蛋白之间形成一个负反馈调节环。5％-10％的人类肿瘤中HDM2蛋白过表达使p53失活。通过抑制肿瘤细胞中p53与MDM2的相互作用进而激活p53蛋白功能已成为寻找癌症药物治疗的热点。已有多个研究从不同的方面证实了这种方法的可行性，这些研究包括：显微注射单克隆抗体，反义寡核苷酸转染，表达p53肽类似物或融合蛋白，以及微生物提取物等。然而，除反义寡核苷酸外，它们都是肽类或大分子物质，成本较高，不利于新药开发和应用。因而，发展非肽类小分子MDM2拮抗剂就成为一个方向。 基于p53-HDM2蛋白复合物晶体结构的阐明，利用计算机辅助模型设计并用化学方法合成了一系列非肽小分子的HDM2抑制剂，我室已毕业的赵剑华博士采用ELISA方法评价了它们与MDM2的亲和性，其中一部分能从p53与MDM2的相互作用中释放p53，诱导肿瘤细胞凋亡。本研究评价了赵剑华博士尚未研究的非肽类小分子的HDM2抑制剂。采用MTT法，获得它们在5种不同肿瘤细胞的IC50，以IC50＜10μg/mL作为筛查标准，最后确定syl-155进一步研究。采用MTT法、蛋白印迹和流式细胞分析检测了syl-155对三种不同p53状态肿瘤细胞的影响：KYSE510(人食管鳞癌细胞系)(突变型p53)、HT1080(人纤维肉瘤细胞系)(野生型p53)、MG63(人骨肉瘤细胞系)(p53缺失)。结果发现，syl-155仅在表达野生型p53的HT1080细胞中刺激p53和p21的积聚，进而诱导细胞G1期阻滞或凋亡；而在表达突变型p53的KYSE510和p53缺失的MG63中则没有观察到这些影响。因此，可以得出这样的结论：非肽类小分子HDM2抑制剂可能用于表达野生型p53肿瘤的治疗。 第二部分StefinA在食管鳞癌组织和细胞中作用的初步研究 恶性肿瘤最重要的特征在于能侵袭周围组织并发生转移。肿瘤侵袭和转移通常是造成肿瘤患者死亡的主要原因。组织蛋白酶B参与肿瘤从非恶性状态进展到恶性状态，以及肿瘤生长、侵袭、转移和血管生成。作为组织蛋白酶B的内源性抑制剂，stefinA表达水平与肿瘤恶性进展的逆向关系的报道越来越多。本研究的目的是分析stefinA在人食管鳞癌组织和细胞中的作用，并进一步评价stefinA用于肿瘤治疗的可能性。对62例配对食管鳞癌组织标本的免疫组织化学和半定量RT-PCR分析表明，与配对正常食管粘膜上皮组织相比，stefinA表达明显下调，这与以往的cDNA微阵列的分析结果一致。共聚焦成像分析证实了stefinA和组织蛋白酶B的共定位。随后，我们稳定转染stefinAcDNA到人EC9706食管鳞癌细胞，发现细胞变大，生长减慢，组织蛋白酶B活性明显降低，Matrigel侵袭被明显抑制，与Matrigel的粘附得到增强，缓解了顺铂诱导的凋亡。同时，也评价了组织蛋白酶B特异性抑制剂CA074Me对EC9706细胞的效果。结果发现，10μMCA074Me也明显抑制了EC9706细胞的组织蛋白酶B活性和Matrigel侵袭。联合10μM的CA074Me与stefinA转染进一步降低了组织蛋白酶B的活性和抑制了Matrigel侵袭。体内实验表明，过表达stefinA延缓了EC9706细胞在裸鼠的增殖；在裸鼠接种的肿瘤中明显减低Ⅷ因子染色强度，抑制了肿瘤血管的生成；完全抑制了EC9706细胞在裸鼠的肺转移，而对照组细胞在裸鼠的肺转移率为50％。因而，认为stefinA在人食管鳞癌细胞的生长，血管生成，侵袭和转移中起着重要作用，并且stefinA可能用于肿瘤的治疗。