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摘要造血是人一生中不断由多能造血干细胞更新造血祖细胞和成熟血细胞的过程。现在认为造血干细胞分化定向到某一个特定血细胞链系以及进一步分化发育为成熟细胞的过程至少部分地是由链系特异的转录因子和广泛表达的转录因子协同作用所控制。一些包含C2H2锌指模体的转录因子在血细胞的分化和发育过程中扮演了重要角色。例如GATA家族、FOG和EKLF等。 我组2000年从人骨髓cDNA文库中筛选到一个新的编码锌指蛋白(命名为HZF1)的cDNA(GenBank注册号：AF244088)。本论文在此基础上研究HZF1基因结构、表达、功能和作用机制。 对hemin诱导的K562细胞中获得的cDNA进行PCR扩增，鉴别到HZF1基因的3种转录物，它们可能由HZF1初级转录物不同的剪接产生。分析发现HZF1基因包含四个外显子和三个内含子。其中一个转录物包含第3、4号外显子，第二个包含第1、3、4号外显子，第三个转录物包含有全部4个外显子。这三种转录物的序列差异仅在5’非翻译区，因此编码的肽链是一致的。HZF1编码区长2010bp，编码670个氨基酸残基，其中包含连续的15个C2H2型和2个C2R2型锌指模体。 HZF1mRNA在人的脑、心、骨骼肌、肾、肝、胰腺和胎肝中高表达；在脾、小肠和骨髓组织中等表达；在结肠、胸腺、肺和外周血白血病中少量表达。HZF1mRNA在各种造血细胞系中都有表达。在hemin诱导K562细胞向红系分化过程中HZF1mRNA表达上调，诱导24h后HZF1mRNA表达水平到达最高。同样，在PMA诱导K562细胞向巨核系分化过程中HZF1mRNA表达上升，诱导60h后表达水平达到峰值。 把HZF1完整读框插入到pEGFP-N1质粒中，构建真核表达载体pEGFP-N1-HZF1，转染NIH3T3细胞，48小时后在荧光显微镜下观察，发现HZF1融合蛋白定位在细胞核中。 为了制备HZF1特异抗体，把编码HZF1非锌指区的DNA顺序插入到pET30a原核表达载体，构建了pET30a-HZF1重组质粒，在大肠杆菌中诱导表达了融合蛋白HZF1-His5，并通过镍柱对表达的融合蛋白进行了纯化。以纯化的蛋白作为免疫抗原，对新西兰兔实施多次多点皮下注射免疫，获得兔抗人HZF1免疫血清。ELISA检测显示血清效价在1：100000以上。证明所获抗体能够与HZF1特异结合。HZF1特异抗体的获得为进一步研究HZF1功能，并为组织和细胞中HZF1的检测奠定了一定基础。 为了分析HZF1在K562细胞分化中的功能作用，构建了一个表达HZF1反义RNA的质粒(pcDNA3.1antiHZF1)，转染K562细胞，筛选稳定转染子。通过联苯胺染色和RT-PCR检测γ-globin表达的方法，发现转染空载体K562pcDNA3.1的稳定转染细胞(对照)在hemin诱导下能够正常向红系分化。而在K562pcDNA3.1antiHZF1稳定转染细胞中，HZF1内源表达被阻遏，并且hemin诱导的红系分化被抑制。通过PI染色和Giemsa染色的方法，发现对照K562pcDNA3.1稳定转染细胞在PMA诱导下能够正常向巨核系细胞分化，但是K562pcDNA3.1antiHZF1稳定转染细胞PMA诱导的巨核系分化明显减弱。我们进一步以真核表达载体pAVu6为基础，设计并插入能表达干扰RNA以特异抑制HZF1mRNA的短DNA顺序，构建了RNA干扰质粒pAVu6HZF1i，转染K562细胞，筛选稳定转染子。实验也发现K562pAVu6HZF1i稳定转染子细胞中，HZF1内源表达被阻遏，并且显著抑制了hemin诱导的红系分化和明显减弱了PMA诱导的巨核细胞分化。总之，利用反义RNA和RNA干扰实验一致地证明了锌指蛋白HZF1在K562细胞红系分化和巨核系分化过程中具有重要作用。 利用双萤光报告基因载体系统，发现HZF1蛋白非锌指区具有很强的转录激活作用，并证明其中的一个肽段(从第49到第197氨基酸)具有几乎和整个非锌指区相同强度的转录激活作用。这些说明锌指蛋白HZF1可能是一个转录活化蛋白，并且其转录激活结构域定位于第49到第197氨基酸区域。 利用抗体和Westernblot方法分析，发现在hemin或PMA诱导的K562pAVu6HZF1i稳定转染子细胞中ERK磷酸化过程被抑制，而hemin或PMA诱导的对照K562pAVu6稳定转染细胞中ERK被快速且大量的磷酸化。由此推论，HZF1可能通过调控ERK信号转导途径，在红系和巨核系分化中发挥重要作用。