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摘要[研究背景与目的]:鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国南方地区尤为高发，由于鼻咽部解剖位置的特殊性及鼻咽癌细胞对射线较为敏感的特点，放射治疗被认为是首选的治疗手段。近年来，由于放疗设备不断更新、放疗技术更趋完善、放射物理及放射生物学研究的不断进步，使NPC单纯放疗的疗效得到较大的提高，目前，单纯放疗5年生存率己超过50％。众所周知，病理类型、临床分期、患者年龄、体质等是影响NPC预后的主要因素，但在日常的临床工作中也不难发现，前述情况基本相似的不同患者，其治疗效果却有较大差异，治疗失败的原因之一为放射抗拒，故研究其抗拒机制、寻找放射增敏途径是提高治愈率的途径之一，在放射治疗前即对其放射敏感性作出预测性分析是目前放射生物学的研究热点之一。 放射线导致细胞损伤的主要靶点是DNA，由放射线的直接作用和电离效应产生的自由基共同导致的DNA单链和双链断裂损伤，其中以DNA双链断(DNAdouble-strandbreak，DSB)裂损伤最为重要。放射敏感性主要与照射后DNA双链断裂的数目及其修复的程度有关，人类的DSB修复以非同源末端连接途径(non-homologyendjoining，NHEJ)为主，参与NHEJ的主要成份有DNA-PKcs、Ku70、Ku80、ligaseⅣ、XRCC4。DNA-PK(DNAdependentproteinkinase)是哺乳动物细胞中参与NHEJ主要的分子途径之一，是由Ku70、Ku80、DNA-PKcs三个亚基组成。其中Ku70、Ku80组成Ku蛋白调节亚基，在DSB修复中起着辨认、结合排列DNA末端并募招催化亚基DNA-PKcs的作用。它由分子量为70kDa的Ku70和80～87kDa的Ku80(又称Ku86)组成，DNA-PK催化亚基DNA-PKcs分子量为470kDa左右，可磷酸化ligaseⅣ、XRCC4从而使得它们活化发挥连接DSB作用，任意一个组分缺陷均会导致DNA-PK活性丧失，而致放射敏感性增加。 DNA-PK与放射敏感性的关系近年来颇受关注，国内外文献报道DNA-PK亚基的表达量可作为直肠癌、喉咽癌、宫颈癌放射敏感性及疾病进展的预测因素，也有文献报道用针对DNA-PKcs、Ku80和Ku70的反义核酸可提高胶质瘤细胞、纤维母细胞、肺癌细胞的放射敏感性。但亦有人研究发现DNA-PK的表达与胶质瘤细胞的放射敏感性无关，但更多的研究表明，其极有可能作为一个放射增敏治疗的新靶点。DNA-PK在人类不同组织中的表达存在很大的差异；它在鼻咽癌细胞中的表达如何及与鼻咽癌放射敏感性的关系如何国内外尚无文献报道。不同的鼻咽癌细胞株或亚株之间的内在放射敏感性均存在很大的差异，已有实验证明来自高分化鳞癌的鼻咽癌细胞株CNE-1比来自低分化鳞癌的鼻咽癌细胞株CNE-2对射线抗拒。其抗拒的机制是否与DSB修复相关的因子DNA-PK表达过高有关?鼻咽癌组织中DNA-PK的表达是否可以预测鼻咽癌患者的放射敏感性?这正是本研究所要回答的问题。 [研究方法]:1、集落形成实验测定鼻咽癌细胞株CNE-1(鼻咽高分化鳞癌细胞)、CNE-2(鼻咽低分化鳞癌细胞)60Co-γ线不同剂量的存活分数，分别用线性二次模型拟合剂量存活曲线并求出放射生物学参数α、β、2Gy存活分数(SF2)、平均抑制剂量(MID)，以及四氮唑兰比色分析法(MTT法)检测60Co-γ线4Gy照射后12h细胞的存活率，以评价两株细胞的放射敏感性。 2、逆转录-荧光定量-多聚酶链反应(RT-FQ-PCR)技术检测60Co-γ线照射前、后不同时间及不同剂量不同放射敏感性鼻咽癌细胞株CNE-1、CNE-2细胞mRNA水平Ku70、Ku80和DNA-PKcs基因的定量表达。 3、采用免疫组织化学技术检测Ku70、Ku80及DNA-PKcs在107例NPC患者组织中的表达情况，并分析各基因蛋白的表达与NPC的临床分期、放射敏感性及生存率之间的关系。 [研究结果]:1、CNE-1在各个剂量点的存活分数均比CNE-2高，MID值分别为2.78：1.61，SF2值分别为0.627：0.341；4Gy照射后12h的存活率分别为88.2％、72.3％；由此可验证本实验室培养的CNE-2细胞放射敏感性显著高于CNE-1细胞。 2、RT-FQ-PCR显示两株细胞中均有Ku70、Ku80和DNA-PKcs基因的表达，其相对表达量之比分别为1.76±0.54(P=0.07)、13.82±3.78(P=0.004)、7.54±2.71(t=4.17，p=0.014)，Ku80和DNA-PKcs基因表达在两株细胞中有显著差异，其中Ku80基因在CNE-2细胞中存在剂量依赖关系，DNA-PKcs基因在CNE-2细胞中存在时间、剂量依赖关系。 3、NPC组织中Ku70、Ku80及DNA-PKcs蛋白在细胞核中均有表达，其各自与NPC临床分期、有无颈淋巴结转移均无关系(P＞0.05)，其中Ku70、Ku80基因蛋白的表达与放疗过程中肿瘤的退缩速度有关，Ku70、Ku80低表达者较高表达者对射线更加敏感，各组分在NPC组织中的表达成正相关(rKu70～Ku80=0.772、rKu70～DNA-PKcs=0.655、rKu80～DNA-PKcs=0.718，P＜0.05)，其中Ku80的表达与NPC的预后有关(P=0.042)，低表达者生存率更高。 [结论]:1、CNE-2细胞的放射敏感性显著高于CNE-1细胞。 2、Ku80和DNA-PKcs的基础表达与鼻咽癌细胞株CNE-1/CNE-2的放射敏感性不同有关，且在CNE-2细胞中其表达存在与照射剂量、时间的依赖关系。 3、Ku70、Ku80和DNA-PKcs蛋白主要定位于CNE-1/CNE-2细胞核，三者的表达具有高度的相关性。Ku70、Ku80与患者放射敏感性有关，Ku80与患者的生存时间密切相关，Ku80低表达者生存时间更长，其可能成为预后的预测指标之一。