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摘要实验目的：干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体，按照组织发生学来源干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞是指个体发育到一定阶段甚至成体，仍存在的一小部分未成熟、未分化细胞，负责组织的更新和修复。那么干细胞为什么能具有多分化，维持未分化状态呢?其机理尚不清楚。在胚胎干细胞研究中，有人发现Oct3/4在维持其未分化状态中起重要作用。Oct3/4是POU家族的转录因子，在胚胎干细胞中表达，在分化细胞中没有表达。Bcl-2是经典的抗凋亡因子，能抑制增殖细胞的凋亡，延长非增殖细胞的存活时间。为了探讨气管干细胞多分化潜能和保持未分化状态的分子机理，本研究采用5-FU制成人支气管、大鼠气管上皮损伤修复模型，观察气管干细胞在增殖、分化过程中Oct3/4、Bcl-2表达的动态变化，探讨其表达意义。 实验材料和方法：1.制备离体大鼠气管损伤模型：250克左右Wistar大鼠，雌雄不限(中国医科大学实验动物中心提供)，腹腔注射10％水合氯醛0.4ml/100g，无菌条件下取出气管，剪成约3mm的气管环，倒置显微镜下观察纤毛摆动良好，取一组织块作正常对照。于DMEM/F12中加入5-FU，终浓度为120mg/ml，将大鼠气管环置于其中，CO2孵箱孵育12小时，换新鲜的DMEM/F12培养液继续培养。分别于0、3、6、9、12、24、48、72小时取出一块组织固定，石蜡包埋，制成3μm厚的组织切片。另取换液后0、3、9、24、48小时的气管组织及正常气管组织，解剖显微镜下机械剥离上皮，每个样品约0.1克，放于1.5mlEppendorf管中，-70℃保存。 2.制备离体人支气管损伤模型：标本均取自因肺癌手术切除肺叶组织，取癌旁3cm外肺组织的支气管(经家属及中国医科大学伦理委员会同意)，处理步骤同大鼠。分别于换液后0、3、9、24、48小时取出组织块固定、包埋、制成3μm厚的组织切片。3.HE染色：光镜下观察结果。 4.免疫组织化学染色：采用SP法，一抗用Santa公司浓缩型Oct3/4抗体(1：100)，DAB显色，PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。 5.间接免疫荧光双染检测Bcl-2、ABCG2的表达：采用两步法，第一抗体为ABCG2(1：100)，TRITC标记的IgG；第二抗体为Bcl-2(1：100)，FITC标记的IgG。DAPI复染细胞核。甘油封片，分别用PBS代替第一、第二抗体作为阴性对照。 6.Westernblotting检测Oct3/4、Bcl-2的表达：取各时段气管上皮组织，提取总蛋白。每孔蛋白上样总量均为20μg。小鼠抗Oct3/4、兔抗Bcl-2抗体(1：400)，过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG、过氧化物酶小鼠抗兔IgG(1：1000)，DAB显色。β-actin为内对照。 结果：气管上皮损伤修复过程中HE染色、Oct3/4免疫组织化学法、Bcl-2间接免疫荧光结果：正常气管上皮为假复层纤毛柱状上皮，已分化细胞中无Oct3/4表达，Bcl-2表达极微弱；5-FU作用12小时后，气管基底膜上仅残留间隔分布的G0期细胞，其中Oct3/4、Bcl-2均开始有明显表达；恢复3-6小时，极扁平细胞渐扁平，胞核狭长，胞浆稀少；恢复9-12小时扁平细胞逐渐变立方，胞浆增加，细胞数增加，此期间Oct3/4、Bcl-2在上皮细胞中的表达呈上升趋势，二者的表达均在9-12小时达到高峰；恢复24小时，上皮细胞出现纤毛结构，这是明显的分化标志，此时Oct3/4表达明显减少；恢复48小时后，只有散在的个别细胞为Oct3/4阳性。Bcl-2在恢复12小时后的上皮细胞中表达减少，与Oct3/4相比Bcl-2表达的下降较为缓和，直至恢复48小时仍有Bcl-2的少量表达。 Oct3/4、Bcl-2Westernblotting结果与上述免疫组织化学及免疫荧光的结果相一致。 结论：1.气管干细胞中含有Oct3/4。在气管干细胞出现的早期，Oct3/4表达，随着干细胞的分化其表达逐渐减少。提示Oct3/4在保持气管干细胞多潜能、未分化状态起重要作用。 2.Bcl-2在气管干细胞增殖早期表达，随着分化而逐渐减少。提示Bcl-2参与维持气管干细胞自身稳定及保持其未分化状态。