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体外研究β淀粉样蛋白25-35的老化机制及石菖蒲活性成分的康复作用

摘要目的:定量描述体外β淀粉样蛋白25-35(β-amyloidprotein,Aβ25-35)的老化并研究其老化机制,确定石菖蒲(Rhizomaacorigraminei,RAG)康复Aβ25-35的活性成分以及机制,寻找容易透过血脑屏障的中药单体,为最终提供化学结构清楚、药理作用和临床疗效明确的治疗阿尔茨海默症(Alzheimer'sDisease,AD)新药提供实验数据。 方法:(1)体外建立AD的化学生物学模型:25μmol/LAβ25-35的PBS(0.1M,pH7.4)溶液在37℃5%CO2培养箱中黑暗孵育后,使用硫黄素T(ThioflavinT,Th-T)荧光分析和圆二色光谱(Circulardichroismspectroscopy,CD)定性和定量分析。(2)RAG挥发油以及水提取液的提取:根据《中国药典》一部附录挥发油提取法甲法制得RAG挥发油;RAG水提取液根据唐红梅(2002)提供的方法制得。(3)Aβ25-35与不同浓度的RAG挥发油或水提取液混合(pH7.4)在37℃5%培养箱中分别黑暗呼育24h和7d,利用CD进行定性和定量分析。(4)Aβ25-35分别与不同浓度的RAG挥发油中的主要成分β-细辛醚和丁香酚混合(pH7.4)在37℃5%培养箱中分别黑暗孵育24h和7d,利用CD进行定性和定量分析,用Th-T荧光测试,分析各组孵育产物的各种二级结构含量以及聚集情况。 结果:(1)随着孵育时间增加,Aβ25-35结构从α-螺旋向β-折叠转化。随着孵育时间的延长,25μmol/LAβ25-35的Th-T荧光强度逐渐增加,其中孵育7d时荧光强度明显升高(P<0.01)。不同时间孵育的Aβ25-35的CD图形发生了明显改变。Aβ25-35水溶液孵育30min主要以α-螺旋结构存在;孵育24h,β-折叠结构占18.59%左右,而α-螺旋结构含量只是占有10.07%左右;孵育到7d后,β-折叠含量增加到64.42%左右,而α-螺旋含量则减少到7.40%左右。 (2)100%RAG水提取液和Aβ25-35共同孵育24h后,α-螺旋含量为20.60%左右,而β-折叠则为5.10%左右,主要以不规则卷曲为主;继续孵育到7d后,α-螺旋含量为100%。RAG挥发油与Aβ25-35共同孵育后,20%挥发油处理24h后Aβ25-35的α-螺旋结构含量达到23.50%左右,而β-折叠结构还有少量;但继续孵育到7d,β-折叠结构含量达到10.88%,而α-螺旋含量减少到17.82%;100%挥发油与Aβ25-35共同孵育24h和7d后,β-折叠都消失,主要以α-螺旋结构存在。 (3)Aβ25-35分别与β-细辛醚和丁香酚孵育后的Th-T荧光都是呈时间和浓度依赖性的。Aβ25-35与10μmol/Lβ-细辛醚孵育24小时后与Aβ25-35单独孵育相比有显著性差异,与100μmol/Lβ-细辛醚孵育孵育7天后的荧光强度显著性最大。Aβ25-35与10μmol/L丁香酚孵育24小时后与Aβ25-35单独孵育相比有显著性差异,而与100μmol/L丁香酚孵育7天后的荧光强度显著性最大。不同浓度的β-细辛醚或者丁香酚分别与Aβ25-35共同孵育24小时或者7天后,α-螺旋都为100%。相比Aβ25-35单独孵育,具有显著性差异。 结论:25μmol/LAβ25-35孵育7d后,发生明显的聚集,二级结构主要以β-折叠为主,形成了大量的淀粉样纤维。RAG活性成分β-细辛醚和丁香酚能有效的抑制Aβ25-35淀粉样纤维的形成,在只有10μmol/L的浓度24小时就可以促使Aβ25-35多肽的二级结构由β-折叠结构向α-螺旋结构转化。

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