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摘要菜心(BrassicacampestrisL．ssp．ChinensisMakinovar．utilisTsenetLee)是广东省栽培面积最大的蔬菜作物。随着生物技术的发展，用生物技术作为辅助手段选育新品种是最近研究的热点和趋势，但菜心是十字花科作物中再生最困难的一种作物，至今尚未建立高效的再生体系和遗传转化体系。本研究以菜心为试验材料，探讨了影响离体再生和遗传转化的一系列因素，初步建立了菜心高效离体再生与遗传转化体系，运用农杆菌介导法将Barnase基因成功导入菜心；并对转基因植株进行了鉴定。主要结果如下： l菜心高频离体再生体系的建立 以MS培养基为基本培养基，探讨了不同基因型、外植体类型与生理状态、激素种类与浓度、琼脂和AgN03浓度对不定芽再生的影响，利用正交设计试验法探讨了NAA、6-BA、AgN03和ABA等四个因素及其组合对菜心带柄子叶不定芽分化的影响。结果表明：种子升汞消毒8-10min可获得最佳质量的无菌苗；4d苗龄的菜心品种“油青四九”的不定芽分化率最高；不同外植体类型中以带叶柄的子叶分化最好；分化培养基中只添加NAA和6-BA，不定芽分化率很低，最高只有14．6％；添加AgN03可显著提高不定芽分化率，其中以4mg／L时分化率最高；ABA和GA3对菜心不定芽的分化具有一定的促进作用，但是浓度过高，反而会抑制不定芽的分化，在MS+1mg／LNAA+2mg／L6-BA+4mg／LAgN03培养基中添加0.1mg／L的ABA，不定芽分化率可提高至52.0％，添加0．5mg／L的GA3时，不定芽分化频率提高至55．9％。在MS+1mg／LNAA+2mg／L6-BA+4mg／LAgN03+0．2mg／LGA3培养基中，琼脂浓度为0.8％时，不定芽分化频率最高，达到61.0％；正交设计结果表明对菜心不定芽分化的最佳组合是：MS+0．6mg／LNAA+6mg／L6-BA+4mg／LAgN03+0．25mg／LABA，不定芽分化率达到75.0％。 不定芽在培养基MS+0.1mg／LIAA+0.2mg／LNAA上的生根率达到82.8％：再生植株移栽基质以泥炭土最好，植株成活率达81.0％。 2菜心高效转化体系的建立 菜心对Km和PPT非常敏感，结果表明5mg／L的Km就几乎能完全抑制不定芽的再生；PPT6．5mg／L时，不定芽分化率仅为8．6％，超过此浓度，不定芽很难分化，且外植体易黄化。故本试验选用Km5mg~或者PPT6．5mg／L作为选择压。 将分化出不定芽的外植体接种至不同浓度PPT的分化培养基中，发现PPT浓度为2．0mg／L时，绝大部分不定芽仍能够保持浓绿色，生长良好；当PPT浓度超过6．5mg／L时，大部分不定芽会逐渐黄化死亡，少数不定芽保持绿色。低浓度(100-200mg／L)的Cef或者Cb对菜心不定芽发生影响不大，但是浓度达到500mg／L会显著抑制不定芽的分化。Cb浓度为200mg／L时，农杆菌增殖受到严重抑制，几乎无农杆菌生长，故抑制农杆菌增殖的适宜Cb浓度为200mg／L。 外植体预培养2d，浸入用MS液体培养基悬浮至OD600=0．3-0．6的农杆菌液中侵染10min，无菌滤纸吸去残留菌液后，～重新接入分化培养基中暗培养2d，转接至Km5mg／L或者PPT6．5mg／L和Cb200mg／L的抑菌筛选培养基上对获得的不定芽进行多代筛选，获得了具Km或者PPT抗性的绿色芽。抗性芽经过生根培养，炼苗移栽，获得26株抗性植株。 3转基因植株的鉴定 提取抗性芽或抗性植株的DNA，进行PCR扩增。检测的45个抗性芽中有10个扩增出目的带，阳性率为22．2％；检测的26株抗性植株中，有8株扩增出目的带，阳性率为30．8％，转化率大约为0．2％。初步表明TA29-Barnase基因已经导入菜心中。同时转基因植株移栽至大田恢复正常生长后，能正常开花，花器官外观结构与对照无明显差异，只是转基因植株开的花，雌蕊(柱头)明显高于雄蕊(花药)，而非转化植株的花，柱头和花药几乎平齐，甚至柱头低于花药，也有的花朵，柱头稍微高于花药。转基因植株花粉明显少于非转化植株。花粉生活力检测结果表明，转基因植株的花粉没有活力，不能萌发；而对照花粉发芽率达90％以上。转基因植株不能正常结籽。