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摘要一、研究背景 各种损伤特别是大面积烧伤导致皮肤缺损的治疗，是尽快封闭创面，由于自体皮源的不足，常导致治疗的失败。组织工程化皮肤研究一直是当前研究的热点，目前尚无特别有效的皮肤替代物应用于临床。而表皮干细胞(keratinocytestemcell，KSC)具有强大的增殖能力，又可向各个阶段表皮细胞分化以维持皮肤新陈代谢，因此KSC作为皮肤重建的“种子细胞”成为研究的热点。如何在体外培养获得足够数量的KSC用于研究及移植，如何在体内外诱导KSC定向分化，对于组织工程皮肤具有重要意义。解决这些问题的关键在于研究KSC增殖与分化的调控机制。 整合素β1是KSC未分化的分子标记之一，Jones等发现高表达整合素β1的表皮细胞具有更高的克隆形成能力，传代次数显著多于低表达的细胞。本室前期通过构建整合素β1小RNA干扰载体，转染KSC，发现下调表达整合素β1蛋白，实验组克隆形成率比对照组降低，促进KSC的分化。提示整合素β1参与KSC的增殖分化的调控。目前虽然对整合素β1参与KSC增殖与分化的调控研究比较多，但是整合素β1的表达调控的机制尚不清楚。 体外实验研究中，KSC通常从不同的个体分离和纯化，存在个体差异和不稳定性，因此寻找一种稳定细胞模型对KSC进行分化与增殖调控机制的研究具有重要意义。HaCaT是来源于正常成人上皮细胞的表皮细胞株，具有无限的增殖能力。研究表明，将HaCaT移植到裸鼠上，HaCaT可以形成分化上皮组织，表达特异性分化蛋白标志，因此HaCaT可以为研究人表皮细胞分化的调控提供一个非常理想的模型。研究拟应用整合素β1启动子荧光素酶报告基因系统，以HaCaT细胞为模型，探讨表皮细胞中整合素β1对增殖分化的影响，以及整合素β1的表达调节机制，为进一步研究表皮干细胞的增殖分化机制奠定基础。 二、研究目的 1、下调人表皮细胞株HaCaT整合素β1，观察其增殖的情况。 2、研究整合素β1启动子在HaCaT中的活性，为研究干细胞分化与增殖调控机制提供理论基础。 三、研究方法 应用本室前期构建好的整合素β1小RNA干扰载体转染HaCaT，通过瞬时转染，用Westernblot检测转染后HaCaT整合素β1蛋白的改变；通过潮霉素持续加压筛选转染细胞，直到转染细胞株单克隆形成，扩大培养，通过计数法描述其生长曲线。 构建和鉴定整合素β1远端和近端启动子双荧光素酶报告载体，转染HaCaT细胞，比较整合素β1远端与近端启动子在HaCaT中的活性，确定其在HaCaT中的转录调控中的的作用。 四、研究结果 整合素β1小干扰RNA载体转染HaCaT能够抑制整合素β1蛋白的表达，生长曲线右移，HaCaT的增殖受到抑制。 成功的从人基因组扩增了整合素β1启动子全长，并将整合素β1的远端与近端启动子构建到荧光素酶报告基因载体。将整合素β1远端与近端启动子转染HaCaT，荧光素酶活性分析表明，远端启动子在整合素β1转录调节中起主要作用。 五、研究结论 整合素β1参与表皮细胞株HaCaT的增殖分化调节，整合素β1的远端启动子对其转录水平的表达调节起主要作用。