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摘要肝脏是结直肠癌转移最常见的器官，临床上结直肠癌患者根治性手术切除后发生肝转移是影响患者预后的主要原因。为了深入研究大肠癌发生、发展及肝转移的分子机理，以提高对大肠癌肝转移的防治效果，我们采用蛋白质组学研究方法，对比分析正常结直肠粘膜、癌原发灶、肝转移灶组织中蛋白组表达差异，分离、鉴定结直肠癌发生和肝转移的相关蛋白，并研究其对结直肠癌细胞生物学行为的影响，从而为筛选临床肿瘤标志物和治疗靶标提供依据。 [材料和方法]一、标本采集：我院结直肠癌伴肝转移患者20例，男女各10例。年龄36-67岁。均行手术治疗，经病理组织学证实，Duke's分期为D期。手术中取手术切除新鲜标本，大肠癌原发灶、正常肠粘膜、肝转移灶组织，贮于液氮中冻存备用。二、蛋白质样品制备及双向凝胶电泳：等电聚焦按照Ampharmacia操作方法进行，组织蛋白提取物经Bradford法定量后取500μg与水化溶液(7M尿素、2M硫脲、2％CHAPS、15mmol/LDTT、05％IPG缓冲液pH3-10、痕量溴酚蓝)混合，总体积200μl，与IPG胶条共同泡胀，总电压伏小时达到40kVh，最大电压至8000V。等电聚焦结束后，用一步平衡法平衡15分钟，平衡液成分为50mmol/LTris缓冲液(pH8.8)，含2％W/VSDS，5mmol/LTBP，6mol/L尿素和30％甘油。然后用12.5％凝胶做第2向SDS-PAGE胶恒流电泳，7h。电泳温度15℃。电泳后考马斯亮兰染色及脱色。三、图象采集与分析：用MicotechK8扫描仪，600dpi分辨率扫描染色凝胶。图象以Melanie3.0软件(GeneBio，Geneva)分析。每种组织三次电泳凝胶图象经背景消减、斑点检测与配比，得到标准胶，再经配比产生差异表达蛋白点数据信息。四、质谱分析及质谱数据库搜寻：用LCQDECAXPplus质谱仪(ThermoFinnigan，USA)对胶上消化后的差异蛋白点进行质谱分析。获得的肽序列数据用Mascot软件在NCBI的nr数据库中搜寻。五、用常规RT-PCR方法克隆差异表达蛋白基因全长cDNA。构建真核表达载体pcDNA3.1-CA。采用脂质体转染法将pcDNA3.1-CA转染人直肠腺癌HR-8348及结肠腺癌lovo细胞。六、结直肠癌细胞生物学行为改变得观察：四唑盐(MTT)比色试验：以转染pcDNA3.-CA的细胞为实验组；以未转染pcDNA3.1-CA的细胞为对照组。分别观察其对5-Fu及奥沙利铂药物的抑制率。抑制率=[1-(实验组吸光度值/空白对照组吸光度值)]×100％。七、统计学处理：应用SPSS12.0统计软件对不同组织蛋白质表达检测结果行t检验。 [结果]一、双向凝胶电泳结果：在20个病例组结直肠癌标本中，原发灶、肝转移灶与正常肠黏膜蛋白质组分在PH7.0-9.5范围内有明显差别。在20组样本中取等质量的蛋白质分别作为癌组织混合物、转移灶混合物和肠黏膜混合物，对这三种组织混合物样品分别平行做了4次双向凝胶电泳，每块胶的蛋白点约为500个。用Melanie3对三种混合样品电泳凝胶上稳定出现的蛋白进行差异分析，发现分子量20000-60000，等电点7.0-9.5之间的区域有明显差异并在平行胶上稳定出现。二、质谱鉴定结果：采用高效液相色谱串联质谱法对凝胶上有明显差异的13个蛋白点进行质谱分析，其中2个蛋白点在肿瘤中表达下调，5个蛋白点在肿瘤组织中表达上调，6个蛋白点在转移组织中表达上调。PH值在7.0-7.5分子量在3000左右有2个蛋白点在10例病人及混合样本中表现出一致的变化，在正常肠粘膜中高表达，而在原发肿瘤组织中未缺失，质谱结果显示此2个蛋白均为碳酸酐酶Ⅱ[HumanCarbonicAnhydraseⅡ(hcaii)(E.C.4.2.1.1)]pH值在7.5-9.0分子量在4000-5000在癌组织中表达上调的蛋白点经质谱鉴定分别为：磷酸甘油酸激酶Ⅰ(phosphoglyceratekinase1)、延胡索酸水合酶(fumaratehydratas)、醛缩酶A(AldolaseA)。pH值在7.5-9.0之间分子量在2000-3000有一蛋白在转移灶中表达上调并稳定出项经质谱鉴定为：人精氨酸酶(Homosapiensarginase)，谷胱甘肽S-转移酶A3(HomosapiensglutathioneS-transferaseA3)。三、碳酸酐酶ⅡcDNA转染对癌细胞生物学行为的影响：应用RT-PCR方法从正常肠粘膜组织和转移灶组织中克隆碳酸酐酶Ⅱ全长cDNA，构建真核表达载体pcDNA3.1，转染HR8348细胞，观察到转染CAII癌细胞MTT法药物敏感试验对5-Fu及奥沙利铂的抑制率较未转染细胞明显增强(P＜0.05)。 [结论] 通过肿瘤与正常组织或细胞的蛋白质表达谱差异分析，是研究肿瘤蛋白质组学的最广泛应用和有效的手段。液相色谱与质谱在线联用避免了几种蛋白集中在同一差异点上对质谱的影响，其精确度和灵敏度都大大超过常规方法。我们采用液质联用比较分析了结直肠癌正常肠黏膜、癌原发灶组织、肝转移灶组织蛋白质表达谱，通过比较3类组织的2-DE凝胶图象发现在pH7-10的碱性蛋白具有明显差异，选择了其中13个高丰度的点做质谱分析。发现碳酸酐酶Ⅱ(CAII)在癌组织和肝转移灶中表达明显下调，说明碳酸酐酶的缺失与大肠癌的发生和转移有关。碳酸酐酶是人体内调节酸碱内环境稳定的关键酶。CAII转染HR8348细胞的实验证明，碳酸酐酶能提高化疗药物对HR8348细胞的抑制率。因此，碳酸酐酶既可能成为筛查结肠癌的有用指标并又可用于防治结直肠癌的复发转移。 人精氨酸酶(Homosapiensarginase)、谷胱甘肽S-转移酶A3(GSTA3)在肝转移灶中表达上调。通过GSTA3转染8348细胞发现二者能明显增加细胞的耐药性，说明GSTA3与肿瘤的复发转移有很大关系，癌细胞耐药性增加，更有利于癌细胞在体内存活，促进肿瘤的复发转移。目前对胱甘肽S-转移酶家族别的酶研究报道较多，但涉及GSTA3与肿瘤关系的报道很少。有待进一步深入研究。人精氨酸酶原是肝脏中的一种水解酶，在鸟氨酸循环的最后过程中起催化作用最终形成尿素和鸟氨酸，本研究证明了精氨酸酶在复发转移灶组织中表达明显上调，精氨酸酶可能成为结直肠癌复发转移的标志物。 在原发结肠癌组织中表达上调的几种蛋白是与糖无氧酵解有关的酶，肿瘤细胞存在着对缺血缺氧的自身调节和适应，其机制主要是通过提高葡萄糖转运、糖酵解(Warburg效应)及形成肿瘤血管体系。如我们限制了糖酵解酶在癌组织中的表达，对抑制癌组织的增长、复发转移可能有积极的意义。