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摘要目的：构建单启动子双表达载体pIRES-p16ink4a-hRb1，观察野生型p16ink4a与hRb1基因联合导入骨肉瘤细胞后，在体外对其细胞增殖、细胞周期的协同调控及体内成瘤性、侵袭性、致死率等生物学行为的影响。 方法：利用基因工程技术，将p16ink4a与hRb1全长cDNA编码区亚克隆至pIRES载体中，依次构建质粒pIRES-p16ink4a-hRb1、pIRES-p16ink4a及pIRES-hRb1并鉴定；阳离子脂质体Metafectene介导转染p16表达缺失，hRb1表达阳性的骨肉瘤细胞株MG63；G418筛选获得抗性克隆；通过逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫印记(WesternBlot)半定量分析外源基因与蛋白表达；流式细胞术分析细胞周期特异性和凋亡率；四甲基偶氮唑蓝(MTT法)检测细胞增殖；并将转基因后肿瘤细胞种植裸鼠，进行成瘤性、侵袭性、致死率等生物学行为进行观察。 结果：PCR、双酶切与测序结果表明质粒构建成功；鉴定联合转染p16ink4a与hRb1后，外源基因在靶细胞mRNA和蛋白水平分别有独立表达。与单基因导入组比，双基因导入组细胞生长抑制率显著上升；所有外源性基因导入组细胞周期均显著阻滞在G1/S期并存在凋亡，但双基因导入组细胞凋亡率显著高于单基因组。裸鼠首次接种成瘤率、肿瘤裸鼠体内生长速度及致死率均显著低于单基因导入组。 结论： 1、首次成功构建了含人p16ink4a及hRb1全长cDNA的单启动子双表达载体pIRES-p16ink4a-hRb1； 2、p16ink4a/hRb1联合导入骨肉瘤细胞后能够稳定表达，与单基因导入组比，能更为显著地使肿瘤细胞周期停滞在G1/S期，抑制细胞生长并有效杀灭肿瘤细胞。在体实验表明导入双基因后的骨肉瘤细胞侵袭能力显著降低。因此，两个关联基因共同调控细胞周期效果显著优于单基因。 3、实验现象的分子机制可能为两点：其一，同时过表达外源性p16ink4a与hRb1基因后，p16ink4a与细胞周期蛋白依赖性激酶CDK4/6结合，阻碍cyclinD1与后者形成复合物，造成CDK4cyclinD1或CDK6cyclinD1激酶失活，抑制hRb1蛋白磷酸化，去磷酸化的hRb1蛋白与转录因子E2F家族形成复合物，阻断了E2F的转录活性，阻滞细胞周期。其二，双基因的共同补充，打断了p16ink4a-cyclinD1/CDK-hRb1信号通路中的负反馈循环圈，从而使p16ink4a与hRb1的生物效应得到充分发挥，更有效地杀灭了肿瘤细胞并降低其生物活性。