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摘要研究背景 尽管起始病因不同，肾小球硬化及肾间质纤维化为各种慢性肾脏疾病(CKD)进展过程中的共同发病通路，是肾功能损害严重程度及远期预后的重要预示标志。参与肾小球硬化及间质纤维化的因素很多，包括细胞因子，生长因子，血管紧张素Ⅱ，内皮素，补体蛋白质，蛋白水解酶，氧化应激及机械因素等。近期研究发现，各种CKD以及糖尿病病人血浆晚期氧化蛋白产物(AOPPs)水平随肾功能不全的进展而升高，提示AOPPs可能在CKD的发展过程中发挥一定作用。 AOPPs的生物化学特征研究表明，发生氧化损伤的蛋白质主要是白蛋白。在体外用血浆白蛋白与次氯酸作用可得到与慢性肾衰竭(CRF)病人血浆中相似的AOPPs。CRF病人血浆AOPPs水平与双酪氨酸(蛋白质氧化的标志)及戊糖素(与氧化应激有关的糖化氧化蛋白)密切相关。因此，AOPPs可能是氧化应激过程中血浆蛋白与含氯氧化剂反应的产物，被认为是蛋白质氧化性损伤的新标志。 本研究以大鼠5/6肾切除(5/6Nx)为慢性肾脏病模型，旨在验证我们提出的假说：AOPPs加速慢性肾脏病肾小球硬化及肾间质纤维化，参与CKD的进展。 研究方法 一.无内毒素AOPPs修饰的大鼠血清白蛋白(AOPPs-RSA)的制备和鉴定，血浆AOPPs浓度按上述方法测定。为去除血脂对吸光度的影响，样本用PBS1∶5稀释后4℃13000rpm离心1小时，抽取下层液体检测。按文献方法测定肾皮质匀浆AOPPs浓度。 二.实验动物处理 分两步行5/6肾切除，第一周切除左肾的2/3，第二周切除右肾。 三.检测指标 1.肾功能及血压：使用试剂盒(肌氨酸，N-甲基甘氨酸氧化酶-过氧化物β1浓度。 结果 一.AOPPs慢性负荷对残肾代偿性增生的影响 二.AOPPs慢性负荷对肾组织损伤的影响 5/6肾切除大鼠从术后第5周开始，肾小球硬化指数和间质纤维化半定量积分增加，并随时间延长而加重。注射AOPPs-RSA的大鼠(1组)与注射RSA(2组)及PBS(3组)大鼠相比，肾小球硬化指数在各时间点均显著增加(P＜0.001)。假手术各组大鼠的组织学检查未见明显肾小球硬化及间质纤维化。 以RSA和PBS处理的假手术组大鼠，a-SMA的表达仅局限于血管平滑肌细胞。5/6肾切除术后，其表达显著增加。5/6肾切除和假手术大鼠注射AOPPs后a-SMA表达均显著增加。 2.病理组织学观察：肾组织经固定、脱水、石蜡包埋，2μm切片，行PAS及Masson染色。在400倍目镜下，应用显微镜网格测位尺计数每个肾小球所占网格数，然后用公式计算肾小球体积(GV)。GV=(P×A)3/2×B/K。其中P代表每个肾小球的网格数；A代表每小格面积；B为1.38，代表肾小球假定作为球体的相关因素；K为1.01，代表肾小球体积有10％的变异系数。 3.免疫组织化学观察；用商品化的抗体作免疫组化染色检测转化生长因子-β1(TGF-β1)、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、巨噬细胞(ED-1阳性细胞)浸润数量、a-平滑肌肌动蛋白(a-SMA)的表达和Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原的蛋白质表达。 4.RT-PCR：用QiagenRNA提取试剂盒从肾皮质中提取总RNA。 5.氧化应激指标测定：采用硫代巴比妥酸反应法测定肾皮质匀浆硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)浓度。肾皮质匀浆谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPx)活性的测定采用5，5'-二硫代对二硝基苯甲酸(DTNB)法测定。 6.炎症反应指标检测：用酶联免疫吸附试验(ELASA)测定尿MCP-1及TGF-β1浓度。 结果 一.AOPPs慢性负荷对残肾代偿性增生的影响 实验中所有大鼠均存活。5/6肾切除大鼠(1组～3组)的残肾重量与体重比值(KW/BW)随时间增加。注射AOPPs-RSA的大鼠(1组)KW/BW值较注射RSA(2组)及PBS(3组)大鼠更高(P＜0.001)。5/6Nx大鼠的肾小球体积亦随时间而增大。注射AOPPs的1组与作为对照的2组和3组相比有显著差异(P＜0.01)。三组假手术组中(4组～6组)，注射AOPPs-RSA的4组与5组和6组相比，肾重/体重及肾小球体积均随时间而增加，第9周和第13周有显著差异(P＜0.05)。 二.AOPPs慢性负荷对肾组织损伤的影响 5/6肾切除大鼠从术后第5周开始，肾小球硬化指数和间质纤维化半定量积分增加，并随时间延长而加重。 与假手术各组比较，假手术各组之间，Ⅰ型胶原和Ⅳ型胶原的沉积无显著差异。 假手术组注射RSA(5组)和PBS(6组)的大鼠肾组织几乎无巨噬细胞浸润。假手术组大鼠(4组)巨噬细胞数也较对照组(5组和6组)增加，但计数显著低于5/6肾切除大鼠(P＜0.05)。 三.AOPPs慢性负荷对肾功能的影响 5/6肾切除后大鼠Scr进行性增高，Ccr下降，尿蛋白增加;在五周前收缩压未升高，但之后逐渐升高。假手术组大鼠未见上述特征。5/6肾切除大鼠长期注射AOPPs后Ccr降低显著快于注射RSA和PBS的对照组(P＜0.001)，尿蛋白排泄率较对照组明显增加(P＜0.001)，而收缩压与对照组相比无明显差异。假手术大鼠注射AOPPs后也出现蛋白尿，但Scr、Ccr及收缩压无明显变化。 四.AOPPs慢性负荷对氧化应激参数的影响 与相应处理的假手术组相比，5/6肾切除注射RSA(2组)和PBS(3组)大鼠的血浆AOPPs水平升高2.0倍，提示肾大部分切除后AOPPs自发性产生，且浓度随时间而增高。5/6肾切除大鼠的肾皮质匀浆中AOPPs浓度也升高。反复注射AOPPs使5/6肾切除和假手术大鼠血浆及肾组织AOPPs水平均显著升高。与注射PBS对照组相比，实验第13周时，5/6肾切除大鼠血浆AOPPs水平升高3.0倍，假手术大鼠升高2.0倍。 血浆AOPPs水平与肾小球硬化指数，肾间质纤维化评分(r=0.817，n=180，P＜0.001)，肾小球巨噬细胞浸润数以及肾间质巨噬细胞浸润数呈正相关。血浆AOPPs与尿蛋白也呈显著相关性。 与同样处理的注射RSA或PBS假手术大鼠相比，5/6肾切除大鼠肾皮质匀浆TBARS水平显著升高。5/6肾切除和假手术大鼠注射AOPPs后TBARS浓度均增加，与同样手术方式的RSA和PBS注射组相比有显著差异。注射RSA(2组)及PBS(3组)的5/6肾切除大鼠较相应处理的假手术大鼠(5组，6组)相比，肾皮质匀浆GSHPx活性降低约40％。 血浆AOPPs与肾组织TBARS显著相关，肾组织AOPPs水平与肾组织TBARS或GSHPx活性也呈显著相关性。 五.AOPPs慢性负荷对MCP-1及TGF-β1表达的影响 与假手术组相比，5/6肾切除大鼠尿MCP-1及TGF-β1水平显著增加，注射AOPPs大鼠(1组)与注射RSA(2组)和PBS(3组)大鼠相比，尿MCP-1和TGF-β1水平升高更为显著。假手术大鼠注射AOPPs(4组)也引起尿MCP-1及TGF-β1增高。免疫组化研究显示，假手术组大鼠仅在肾小管上皮细胞有轻微MCP-1或TGF-β1染色。5/6肾切除大鼠肾小球和小管均可见阳性染色，注射AOPPs显著增加5/6肾切除和假手术大鼠MCP-1和TGF-β1染色。RT-PCR结果显示，5/6肾切除术后，MCP-1及TGF-β1mRNA表达增加，AOPPs负荷显著增加MCP-1及TGF-β1mRNA表达。 结论 我们的研究证实，在5/6肾切除模型中，AOPPs是一类促进慢性肾脏病进展的重要新介质。AOPPs蓄积通过氧化还原敏感的炎症通路促进肾脏纤维化，使肾功能恶化。尽管用动物实验诠释临床疾病需要谨慎，但我们的研究结果揭示了慢性肾组织纤维化和慢性肾脏病进展的新的机制。