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摘要背景 目前看来，冠心病的发病率逐年增加，其直接的后果是心肌供血减少导致细胞死亡或功能受损，从而产生心功能损害，严重时造成心力衰竭。 干细胞是一族具有自我复制和多向分化能力的细胞。已有许多的临床前期试验表明干细胞治疗可能通过修复或再生受损心肌，增强血管新生等作用，缩小心肌梗死的面积，改善心功能。最近研究将某些类型的干细胞通过细胞移植的方法种植到病变区域，使其增生分化为心肌细胞和/或血管内皮细胞，从而增加和恢复具有完善收缩功能的心肌细胞数目，逆转心室重塑，取得了鼓舞人心的成就。 虽然干细胞移植治疗缺血性心脏病已成为新的研究热点，但也存在不少问题，如：移植干细胞的类型、移植方法、移植时间的选择等等。本研究从以下两个大的方面展开：(1)骨髓干细胞能否在梗死心肌内存活并且分化成为新的心肌细胞从而改善心功能?(2)缺血/再灌注后移植干细胞有否良好作用。 目的： (1)建立心肌梗死及缺血/再灌注模型；(2)观察骨髓间充质干细胞培养、制备的过程及方法：(3)探讨骨髓间充质干细胞移植的方法、时机； (4)观察标记的骨髓干细胞能否在梗死及再灌注心肌内存活并且分化成为新的心肌细胞；(5)观察骨髓干细胞移植对心功能改善及减轻再灌注损伤的作用。 方法： 1．骨髓间充质干细胞(MSCs)的制备及细胞标记用离心的方法分离出大白鼠的股骨骨髓，淋巴细胞分离液分离单个核细胞，经冲洗后，培养、传代，得到第三代骨髓间充质干细胞(P3)，于培养液中加入终浓度为50ug/ml的4,6二乙酰基-2-苯基吲哚(DAPI)，孵育，然后用Hanks平衡盐液洗去未结合的DAPI。利用荧光显微镜观察计数同一个视野细胞核发出蓝色荧光的细胞数目，每个标本随机计数lO个高倍视野取其平均值，计算二者的比值即得到DAPI的标记率。 2．急性心肌梗死(AMI)和缺血/再灌注(CIR)动物模型的制备将大白鼠充分麻醉后，固定、备皮、铺单，在心电监护和呼吸辅助的条件下，取胸骨正中切口，暴露心脏，以左心耳与肺动脉圆锥间的左冠状静脉主干为标志结扎左冠状动脉前降支(缺血/再灌注动物模型结扎时丝线与心外膜之间放置一塑料软管)，观察前壁部分区域颜色变浅及心电图有梗死改变即为AMI模型，抽出塑料软管即为CIR模型。 3细胞移植：将动物模型再次开胸，充分暴露心脏，把干细胞悬液以点注射的方式局部注射入梗死灶的周边区，并以缝线标记注射点后关胸。 4．超声心动图检测心功能： 选择切面包括：心尖四腔、两腔切面，左室长轴和短轴切面。测定参数包括：左室射血分数、左室短轴缩短率、左室舒张末期直径、左室收缩末期直径、左室舒张末期前壁厚度、左室收缩末期前壁厚度、左室舒张末期后壁厚度、左室收缩末期后壁厚度、主动脉血流速度、心率。 5．免疫荧光检查干细胞向心肌细胞的分化过量麻醉处死实验动物，迅速取出心脏，取缝线标记处的心肌制成8um厚的连续冰冻切片标本，加入抗心肌a肌球蛋白重链(α-myosin heavy chain，a-MHO)作为一抗，然后滴加异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，进行激光共聚焦显微镜检查，检测DAPI示踪的细胞是否具有心肌细胞特异性标记抗α-肌球蛋白重链。DAPI测试参数：紫外光(UV)激发，Ex/Em：356nm/BP461，针孔：1.0；FITC测试参数：Argon激光，Ex/Em：488nm/BP505-550，针孔：1.0。 6.HE常规染色观察 完整取出心脏，将房室沟以上部分完全剪去，观察外形。然后将心肌置于10％福尔马林内浸泡固定24小时以上，1周内取出标本，进行脱水、透明、浸蜡和包埋，制成蜡块备用。切成4Um厚的切片，固定于多聚赖氨酸处理的防脱载玻片上。石蜡切片，常规脱蜡，置入Harris苏木素液5分钟左右，水洗1分钟，75％盐酸乙醇分化30秒，水洗，氨水处理30秒，水洗1分钟，酸化伊红乙醇液染12分钟，自来水快速冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明后中性树胶封固。在BH2型OLYMPUS照像显微镜下，以100～400放大倍率，观察心肌组织结构变化并选取典型视野照相。 7.用左心导管检查心功能充分麻醉大鼠，固定分离右侧颈总动脉，插入内充肝素生理盐水的塑料管至左室腔，用多导生理记录仪描记左室缩．舒压差(LVEDP)、左室等容收缩/舒张期压力上升或下降最大速率(±LVdp/dtmax)以反映左室收缩与舒张功能．所有电信号均用计算机软件分析处理。 8梗死区心肌SOD和MDA水平测定采用过量戊巴比妥腹腔注射(100mg/Kg)处死，取出梗死区心肌组织约0.2g用生理盐水冲洗干净，眼科剪刀剪碎，置组织粉碎机上粉碎研磨至糊状，用生理盐水配置成10％、1％的组织匀浆分别离心取上清，严格按照操作表进行操作。 9．统计学分析 本研究计量资料用x±s表示，所有分析均用SPSS10.0统计软件包完成，对计量资料采用小样本t检验，包括配对设计资料的t检验和成组设计资料的t检验。统计结果以P≤0.05为有显著意义。 结果： 1．标记的骨髓干细胞在梗死心肌内存留并且分化为心肌样细胞骨髓干细胞植入梗死心肌后4周，实验组动物的梗死心肌冰冻切片内，激光共聚焦显微镜下可见DAPI标记的细胞核呈蓝色，这些细胞播散并迁移至整个梗死区域，正常心肌内未见浸润。合成紫外光(UV)激发和Argon激光激发的两种荧光细胞图像，可见细胞切面图：DAPI示踪的细胞核呈现蓝色荧光，a-MHC抗体阳性的细胞浆呈现绿色荧光。 2．多功能超声心动图检查心功能本研究采用随机分组，因此在基础状态下两组大白鼠在术前所测LVDd、LVDs、LVFTd、LVFTs、EF、FS等心功能各项主要的指标均无显著性差异。心肌的厚度、活动度及回声均无异常。在再次开胸注射骨髓干细胞/培养基后两周，两组动物左室内径出现扩大，EF及FS下降，并且两组相比没有显著性差异。二维超声在两组均发现前壁部分区域运动减弱、厚度变薄及回声增强，后壁代偿性运动增强、心肌略有增厚。于注射后4周开始，对照组左室内径继续增大，EF及FS显著下降，后壁代偿的程度更加明显，二维切面上可以看到前壁部分区域有运动消失现象，部分可见巨大的室壁瘤形成。在细胞移植组，扩大的左室内径开始减小，EF及FS改善，同对照组相比有显著性差异，二维超声没有发现运动消失及室壁瘤形成。 3．苏木素一伊红(HE)常规染色于注射后2周开始观察，对照组心肌细胞基本结构紊乱，核固缩明显，染色加深，甚至溶解消失，发生灶性分布的玻璃样变性，肌纤维断裂，胶原增生，心肌组织逐渐被瘫痕组织替代，未发现核浆比例大的细胞。在实验组细胞移植区域，可见炎症细胞浸润，出现核浆比例较大、类似胎心或新生心室细胞的细胞，生长排列方向与肌纤维一致，心肌细胞的纤维化被有效抑制，瘢痕组织形成较少见。 4．梗死区植入细胞的免疫荧光检查细胞移植2周后，荧光显微镜显示，所有干细胞移植组梗死区心肌组织标本中均可见DAPI标记的蓝色荧光供体细胞核，分布比较广泛，呈椭圆形，似心肌细胞核，并与心肌纤维排列方向一致，在蓝色背景下细胞核深染，与其他细胞成分对比清楚；Argon激光激发条件下，心肌细胞胞浆呈绿色荧光。而在对照组，没有发现有DAPI标记的蓝色荧光细胞核及绿色细胞胞浆。 5．左心导管检测心功能CIRI对照组和CIRI移植组左室收缩压、左室压最大上升速率均较假手术组明显降低，而左室舒张压、左室压最大下降速率均较假手术组明显升高(P≤0.01)；，CIRI移植组左室收缩压、左室压最大上升速率较CIRI对照组升高而左室舒张压、左室压最大下降速率较对照组下降(P≤0.01)。 6．心肌组织SOD及MDA检测结果 与假手术组相比，CIRI对照组及CIRI移植组梗死区心肌组织中SOD活力明显降低，MDA产生明显增多(P≤0.01)；CIRI移植组与CIRI对照组相比，SOD下降程度小，MDA产生的数量少(P≤0.01)。 结论 (1)经心外膜注射移植骨髓间充质干细胞是可行的。在本研究所做的动物实验中，将操作方法略做改进，AMI模型动物经注射干细胞后，均获得存活，无一例出现严重并发症。 (2)骨髓间充质干细胞移植治疗对AMI后心肌的修复及心功能的改善效果确切。经多重指标检测发现，梗死区有新生细胞生长，心功能各项参数明显改善。 (3)在AMI后1周移植干细胞效果好。在本研究中是在发生AMI后1周移植，效果良好，其他时间如：AMI后即刻，AMI再通后，AMI后2周或更长时间是否可行还有必要进行进一步研究。 (4)干细胞移植较安全。移植后连续观察12周没有发生严重的并发症，心肌上没有形成其他异常组织。 (5)移植干细胞修复心肌及改善心功能的机制，本研究中没有进行探讨。现在存在很多观点，大多数的研究认为其能增加心肌细胞及微血管的数量。到底哪一种最有说服力，还要做进一步的研究。 (6)有较好的临床应用前景。通过动物实验，我们已经肯定了这种治疗方法的效果，小规模的临床研究也证实了其安全性、可靠性及有效性。 (7)心肌缺血/再灌注后移植骨髓间充质干细胞可改善左心功能。 (8)移植骨髓间充质干细胞可减轻缺血/再灌注损伤。