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摘要糖，作为生物体内一类重要的生物分子，不仅广泛存在于生物体内，而且其功能涉及到许多重要疾病的发生发展过程。尤其是细胞表面的糖蛋白及糖脂复合物中的寡糖结构，在许多生命过程中都发挥着重要的作用，包括细胞的通讯与分化过程，分子识别与信号转导，以及生物的生理、病理和发育过程。因此，寡糖已被普遍视作一种潜在药物广泛应用于癌症的免疫治疗和预防感染及中和毒素的治疗。目前已有研究证实，寡糖结构决定了糖蛋白药物的生物活性、药物动力学和药效。因此，进一步研究各种寡糖结构的生物功能无疑对生物活性多糖的应用具有重要的意义。 然而，由于目前无法提供足够数量的寡糖，已造成寡糖在现代药物学领域中的应用受到严重制约。当前对于蛋白与核酸生物功能的研究进行的比较深入，其相应的体外合成技术也比较成熟。与之相反，复杂的糖分子及其体外合成的研究则进展缓慢，其主要困难在于糖链结构的多样性与复杂性，即糖苷键种类、立体结构及分枝的多样性与复杂性。此外，DNA与蛋白的一级结构是由模版编码的，而糖的生物合成则需要各种不同起源的酶的协同作用才能实现。特定糖链的合成技术已成为研究其细胞学功能的瓶颈。因此，研究糖链的合成已成为糖生物学领域的一个重要方面，目前世界各地的实验室已在该领域开展了许多相关研究工作。 当前复杂糖链的合成主要有两种策略，即化学法合成与酶法合成。化学合成具有机动灵活的特点，可以合成天然与非天然的糖链结构。各种有机保护官能团的应用扩展了化学合成的范围，可以获得大量非天然的糖分子。但是化学合成糖链在实际应用中比较困难，其步骤多、产量低、立体选择性差的特点在某种程度上使化学法合成受到了限制。而利用生物天然合成途径的酶法合成具有反应条件温和、步骤简单、产量高的优势，更重要的是，酶法合成具有良好的立体选择性，因此近年来糖链的酶法合成受到了广泛的重视。然而酶法合成也具有一定的缺点，其应用在很大程度上受到了昂贵的糖核苷酸供体的限制。通过改造生物合成途径，利用糖核苷酸再生的技术已被证明是极具前景的获得昂贵核苷酸供体的策略。 我们课题组“超级菌/超级粒”技术的目的是达到糖核苷酸的高效再生。这种概念可进一步贯彻于寡糖链的生物酶法合成。即将寡糖生物合成途径中所需的多种酶基因克隆到同一个质粒中，得到一个具有重组多酶基因簇的人造质粒，将该多酶基因簇质粒转化入单一微生物菌株中，通过工程菌的发酵提供从单糖到寡糖生物合成途径中所需的每一种酶蛋白。该技术的优点是利用单一的工程菌株催化整个寡糖生物合成系统，节省了多种酶蛋白分别操作的复杂过程，从而使得这种寡糖合成的“超级菌超级粒”技术高效低耗。 本论文成功应用“超级菌/超级粒”技术在克级水平合成了具有生物医学重要意义的糖类物质前体CMP-Neu5Ac以及糖鞘脂Gb3与iGb3： (1)通过改造生物合成途径，构建工程菌株高效合成糖类物质前体CMP-Neu5Ac。CMP-Neu5Ac是合成唾液酸类寡糖的重要前体物质。含有唾液酸的寡糖是一类重要的糖分子，在细胞通讯、病毒侵染、毒素结合与肿瘤增殖中起到重要的作用。目前生物治疗领域对唾液酸类寡糖的需求日益增加，经济高效地大量合成唾液酸类寡糖物质前体CMP-Neu5Ac已成为满足该需求的重要一步。利用细菌生物合成CMP-Neu5Ac涉及到一系列生化反应过程，其中Neu5Ac醛缩酶与CMP-Neu5Ac合成酶是CMP-Neu5Ac生物合成的关键酶。试验证实，Neu5Ac醛缩酶与CMP-Neu5Ac合成酶的体外表达同样具有生物活性。将NetJ5Ac醛缩酶与CMP-Neu5Ac合成酶的两个编码基因构建到同一个表达载体上，通过同一个T7启动子表达了具有双重功能的融合蛋白。酶活测试表明，分别发酵Neu5Ac醛缩酶与CMP-Neu5Ac合成酶，可以得到4000 U/L和200 U/L的活性，融合表达Neu5Ac醛缩酶和CMP-Neu5Ac合成酶，可以得到与分别发酵两个酶蛋白所得酶活得相当水平。具有Neu5Ac醛缩酶与CMP-Neu5Ac合成酶双重活性的融合蛋白，可以利用ManNAc、丙酮酸和C。TP作为底物合成产物CMP．Neu5Ac。利用带有重组质粒的工程细菌细胞可以直接大量合成CMP-Neu5Ac，避免了多种酶蛋白的分别纯化步骤，在大生产过程中尤为经济。实验结果证实，利用“超级粒”技术成功地在克级水平生产了糖前体物质CMP-Neu5Ac。更为重要的是，利用生物合成过程中的关键酶可以大大简化“超级粒”技术，重新构建更为经济高效的合成途径。该研究也为大规模利用工程细菌经济的生物合成唾液酸类寡糖提供了可能。 (2)化学-酶法联合高效合成具有生物医学重要意义的糖鞘脂Gb3与iGb3。Gb3位于细胞表面，是产生志贺氏细菌性痢疾毒性的病原菌的结合与侵染位点。因此，生物医学研究认为，Gb3和其他的Gb3三糖类分子具有潜在的治疗作用。iGb3是人NKT细胞应激体内恶性肿瘤、感染及自身免疫疾病等一系列生物状态时的重要内生配体，此项发现，使研究者对自免疫和移植排斥相关免疫环节的认识获得突破性进展。因此Gb3与iGb3在生物医学研究中具有重要的治疗价值。目前对Gb3和iGb3细胞生物学研究的瓶颈就是对这两种重要的糖鞘脂知之甚少。从生物体内提取和纯化Gb3与iGb3需要特殊的生化与分析设备，而且产量低，只能达到毫克级。目前已有利用三糖供体和脂受体化学方法合成Gb3与iGb3的报道，但合成步骤极其复杂。化学合成三糖供体需要不断地保护、脱保护与糖基化过程，需要17-19步才能完成，步骤繁琐。本论文利用葡萄糖-1-磷酸尿苷转移酶(GalU)、UDP-Gal异构酶(GalE)、半乳糖基转移酶三个酶系统分别于固相、液相两个体系在克级水平高效合成Gb3三糖(产率82％)与iGb3三糖(产率78％)。进而以Gb3与iGb3三糖与化学合成的脂受体结合，合成完整的糖鞘脂Gb3与iGb3，大大简化了现有的化学合成步骤。两种保护官能团benzoyl和pivaloyl被用做供体的糖基化试验，结构证明，pivaloyl是比较理想的选择，其产率可以高达92％。本文将重组酶技术与化学合成技术结合，在克级水平高效生产了糖鞘脂。试验表明，该方法可以进一步扩展到其他糖类复合物的合成中去，如糖肽的合成。糖类复合物分子中的寡糖部分可以利用酶技术有效的合成，而体外的多肽合成技术已经十分成熟。将这两种技术结合，就可以获得大分子的糖类复合物。该方法的另一个应用就是利用生物合成途径中的酶的底物选择特异性与多样性，从而将非天然的底物类似物引入合成途径中，获得人工修饰的非天然糖类复合物。这些带有底物类似物的非天然糖类复合物是研究细胞中糖类复合物功能的有效工具，同时也可以作为详细研究生物合成途径的分子探针。此外，还可以应用于监测细胞表面与疾病发作相关的糖基化现象的异常表达。概而言之，本论文发展了一种高效生物合成复杂糖链的通用策略，同时为糖生物学的研究提供了有效手段。