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摘要乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染肝细胞所致肝炎、肝硬化甚至肝癌是危及全世界，尤其是我国人民健康的重要原因。尽管到目前为止，HBV的确切致病机制尚存在争议，但已有研究证实，HBV感染所致肝细胞凋亡失衡不仅是乙肝患者肝细胞损伤的重要分子机制之一，而且在乙肝患者不同的预后、转归中发挥着不容忽视的、甚至是决定性的作用。 众多研究表明，TNFα、FasL等凋亡诱导分子在HBV感染所致肝细胞损伤中发挥重要作用。肿瘤坏死因子凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor-relatedapoptosis-inducing ligand，TRAIL)是于1994年被克隆、命名的肿瘤坏死因子家族成员，其最为显著的特点是：可选择性地诱导肿瘤细胞或者病毒感染细胞的凋亡，而对正常组织细胞无明显毒性。研究发现，许多因素(病毒/病毒编码蛋白、射线、药物等)可改变细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性。我室在前期研究中首次提出并报道了，HBV感染可提高肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，可能在HBV感染所致肝细胞损伤中发挥一定的作用。但是，HBV全基因组至少包含四个开放性读码框架(Open reading frame，ORF)，编码合成相应病毒蛋白质，那么究竟哪一个片段是导致HBV影响TRAIL诱导凋亡的关键性基因区段呢?这些关键性基因区段在TRAIL诱导凋亡通路中的关键性作用位点又是什么呢?因此，在前期工作的基础上，本课题在国内外率先开展了有关HBV影响TRAIL诱导凋亡的机制研究，并取得了一定的研究成果。 目的： 1.筛选影响TRAIL诱导凋亡的HBV关键片段，并初步探讨其机制。 2.研究所筛选的HBV基因关键片段的表达对TRAIL诱导肝癌细胞凋亡的影响，并深入探讨其作用于TRAIL凋亡通路的关键位点。 3.动物实验进一步证实HBx基因的表达对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响。 方法： 1．反义封闭HBV全基因转染细胞HepG2.2.15中HBx、HBpreS2的表达，观 察其对TRAIL诱导细胞凋亡的影响及与细胞表面TRAIL受体表达的关系 1.1 PS-ausODNs/HBx、PS-asODNs/preS2的体外抗病毒效应 将PS-asODNs/HBx或PS-asODNs/preS2按10μmol/L的浓度作用于处于对数生长期的HepG2.2.15细胞，同时设立无关序列PS-rODNs作用对照组，孵育24h或48h，收集培养液上清，ELISA法检测HBsAg和HBeAg的表达情况，荧光定量PCR检测HBVDNA的含量。 1.2 PS-asODNs/HBx、PS-asODNs/preS2对TRAIL诱导HepG2.2.15细胞凋亡的 影响 不同浓度TRAIL作用于HepG2.2.15细胞，MTT法检测不同浓度TRAIL对HepG2.2.15细胞的生长抑制情况，确定最佳作用浓度。将PS-asODNs/HBx、PS-asOl3Ns/preS2或PS-rODNs按10μmol/L的浓度作用于处于对数生长期的HepG2.2.15细胞，24h后，加入100ng/mL TRAIL继续孵育24h，MTT法检测细胞生长增殖情况，TUNEL流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。 1.3 PS-asODNs/HBx、PS-asODNs/pmS2对HepG2.2.15细胞TRAIL受体表达的 影响 PS-asODNs/HBx、PS-asODNs/preS2或PS-rODNs作用于HepG2.2.15细胞，24h后收集细胞。半定量RT-PCR检测TRAIL受体mRNA水平的表达，Westernblot、流式细胞术检测TRAIL受体蛋白质水平的表达。 2．HBx、MHBs(t)的表达对TRAIL诱导凋亡的影响及其分子机制的体外研究 2.1包含HBx、MHBs(t)基因真核表达载体的构建 设计、合成针对HBx、MHBs(t)基因的特异性引物，以pUCl9/3HBV(aar亚型)为模板，PCR扩增获得相应的基因片段。PCR反应产物经酶切定向克隆 入真核表达载体pcDNA3.0内，转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，经抗性筛选、酶切、DNA测序鉴定获得阳性重组子，并被分别命名为pcDNA-HBx、pcDNA-MHBs(t)。 2.2稳定表达HBx、MHBs(t)蛋白肝癌细胞模型的建立 pcDNA-HBx、pcDNA-MHBs(t)及空载体对照pcDNA3.0以阳离子脂质体介导的方式分别转染肝癌细胞BEL7402，经G418筛选4周后，获得阳性细胞克隆。传代扩增，获得稳定细胞株，并分别命名为BEL7402-HBx，BEL7402-MHBs(t)及BEL7402-cDNA3细胞。半定量RT-PCR分别检测HBx、MHBs(t)mRNA的表达，Western blot检测HBx蛋白质的表达。 2.3HBx、Mrms(t)蛋白的表达对TRAIL诱导凋亡的影响 不同浓度TRAIL分别作用BEL7402-HBx、BEL7402-MHBs(t)、BEL7402-cDNA3及BEL7402细胞，24h后MTT法检测不同浓度TRAIL对各组细胞的生长抑制情况，确定最佳作用浓度。以10ng/mL TRAIL分别作用于各组细胞，24h后TUNEL流式细胞术检测各组细胞的凋亡率。 2.4HBx、Mires(t)的表达影响TRAIL诱导凋亡的机制研究 1)胞膜受体水平：半定量RT-PCR分别检测BEL7402-HBx、BEL7402-MHBs(t)、BEL7402-cDNA3及BEL7402细胞中TRAIL受体mRNA水平的表达，Westem blot、流式细胞术检测各组细胞TRAIL受体蛋白质水平的表达。 2)胞浆凋亡通路水平：Caspase 3活性检测试剂盒、Western blot分别检测10ng/mL TRAIL作用24h后，BEL7402-HBx、BEL7402-MHBs(t)、BEL7402-cDNA3及BEL7402细胞中caspase 3的活化水平。Western blot检测TRAIL作用后各组细胞caspase 8，caspase 9，Bid的活化水平。RT-PCR、Western blot检测各组细胞Bax、FLIP的表达水平。 3.小干扰RNA封闭Bax的表达对HBx影响TRAIL诱导凋亡的逆转效应 3.1阳性对照载体验证小干扰RNA系统在BEL7402-HBx细胞中的作用效率 合成针对内参照基因GAPDH的阳性对照小干扰序列，利用pSilencer3.1-H1 neo小干扰RNA载体系统，构建阳性对照载体pGAPDH-Si，同时构建无关序列对照载体pContro1-Si，DNA序列测定鉴定重组质粒的正确性。质粒pGAPDH-Si、pC0ntro1-Si分别经阳离子脂质体介导转染BEL74po2-HBx细胞，72h后半定量 RT-PCR检测各组细胞GAPDH mRNA水平的表达。 3.2有效封闭 Bax 表达的小干扰 RNA 载体的筛选 设计、合成两对特异性针对Bax基因的小干扰RNA序列，以pSilencer3.1-H1neo为母本，分别构建小干扰RNA载体pBaxl72-Si、pBax382-Si，DNA序列测定鉴定重组质粒的正确性。质粒pBaxl72-Si、pBax382-Si及对照载体pContro1-Si经阳离子脂质体介导分别转染BEL7402-HBx细胞，72h后半定量RT-PCR、荧光定量RT-PCR、Westem blot分别检测各转染组细胞Bax mRNA水平、蛋白质水平的表达，筛选有效阻断Bax表达的小干扰RNA载体。 3.3小干扰RNA封闭Bax的表达对HBx影响TRAIL诱导凋亡的逆转效应 pBax382-Si和对照载体pControl-Si经阳离子脂质体介导分别转染BEL7402-HBx细胞，72h后各组细胞加入10ng/mL TRAIL继续作用24h，TUNEL流式细胞术检测细胞凋亡情况。 3.4小干扰RNA封闭Bax的表达对TRAIL凋亡通路分子活化水平的影响 pBax382-Si和对照载体pContro1-Si经阳离子脂质体介导分别转染BEL7402-HBx细胞，72h后各组细胞加入10ng/mL TRAIL继续作用24h，Westernblot分别检测caspase 3，8，9及Bid的活化水平。 4.HBx体内表达对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响 4.1腺病毒的体外扩增、病毒滴度测定和活性检测 TRAIL腺病毒或空载体腺病毒感染HEK293细胞，72h后出现明显细胞病变，分别收集培养上清和细胞。反复冻融裂解细胞，收集病毒颗粒。低熔点琼脂糖空斑形成试验测定病毒滴度，并将其作用于BEL7402细胞，MTT法检测病毒的体外杀伤活性。 4.2 HBx基因在小鼠肝脏细胞中的表达 pcDNA-HBx或空载体pcDNA3.0经尾静脉水压注射法注射入BALB/c小鼠体内，24h后尾静脉注射TRAIL腺病毒或者空载体腺病毒，再经24h处死小鼠，提取肝组织RNA和总蛋白质，RT-PCR检测HBx mRNA的表达，Western blot检测HBx蛋白的表达。 4.3 HBx的表达对TRAIL腺病毒诱导肝细胞凋亡的影响 pcDNA-HBx或空载体pcDNA3.0经尾静脉水压注射法注射入BALB/c小鼠 体内，24h后尾静脉注射TRAIL腺病毒或者空载体腺病毒，再经24h处死小鼠，PI流式细胞术检测肝细胞凋亡情况。同时，测定血清谷丙转氨酶水平及肝组织病理切片观察肝组织损伤情况。 结果 1．反义封闭HBx、HBpreS2的表达可下调HepG2.2.15细胞对TRAIL诱导凋亡 的敏感性但不影响TRAIL受体的表达水平 1．1 PS-asODNs/HBx、PS-asODNs/preS2可有效抑制HBsAg、HBeAg的表达和 HBV DNA 的合成 ELISA检测结果显示，PS-asODNs/HBx作用组和PS-asODNs/preS2作用组与对照组细胞相比，HBsAg、HBeAg的表达显著降低(P<0.01)。荧光定量PCR结果显示，PS-asODNs/HBx和PS-asODNs/preS2均可显著降低HBV DNA的合成(P<0.05或P<0.01)。 1．2 PS-asODNs/HBx、PS-asODNs/preS2可下调HepG2.2.15细胞对TRAIL诱导 凋亡的敏感性 MTT法检测结果显示，当TRAIL作用浓度为100ng/mL时，生长抑制率接近50％，因此将该浓度确定为其后作用于HepG2.2.15细胞的最佳浓度。TUNEL流式细胞术检测结果显示，PS-asODNs/HBx或PS-asODNs/preS2与TRAIL同时作用组细胞凋亡率分别为14％±9.5％、15.7±6.7％，显著低于对照组细胞(65％±12％) (P<0.05)，MTT结果与TUNEL流式细胞术结果相吻合。 1．3 PS-asODNs/HBx、PS-asODNs/preS2不影响HepG2.2.15细胞表面TRAIL受 体的表达水平 半定量RT-PCR、Western blot和流式细胞术结果均显示，PS-asODNs/HBx作用组和PS-asODNs/preS2作用组与对照组细胞相比，TRAIL受体mRNA水平和蛋白质水平的表达均无显著性差异(P>0.05)。 2．HBx、MHBs(t)的表达上调TRAIL诱导的细胞凋亡及其分子机制的体外研究 2．1成功构建pcDNA-HBx、peDNA-MHBs(t)真核表达载体 PCR成功扩增HBx、MHBs(t)基因片段，酶切、连接构建重组载体，并成功转化宿主菌，经抗性筛选、酶切鉴定、DNA序列分析获得阳性重组质粒pcDNA-HBx和pcDNA-MHBs(t)。 2．2成功建立稳定表达HBx、MHBs(t)的肝癌细胞模型 pcDNA-HBx、pcDNA-MHBs(t)或pcDNA3.0转染肝癌细胞BEL7402，经G418筛选，获得稳定细胞株，分别命名为BEL7402-HBx，BEL7402-MHBs(t)及BEL7402-cDNA3细胞。半定量RT-PCR可在BEL7402-HBx，BEL7402-MHBs(t)细胞中分别检测到HBx、MHBs(t)mRNA的表达，Western blot可在BEL7402-HBx细胞中检测到HBx蛋白质的表达。 2．3 HBx、M/ms(t)的表达上调TRAIL诱导的细胞凋亡 MTT检测结果显示，相同浓度TRAIL对BEL7402-HBx，BEL7402-MHBs(t)细胞较对照组细胞有更高的生长抑制率，当作用浓度为10ng/mL时，差异最为显著，因此将该浓度作为其后实验的作用浓度。TUNEL流式细胞术结果显示，10ng/mL TRAIL作用下，BEL7402-HBx，BEL7402-MHBs(t)细胞较对照组细胞相比有更高的凋亡率(p<O.05)。 2．4 HBx、M/ms(t)的表达上调TRAIL诱导凋亡的机制研究 1)胞膜受体水平：半定量RT-PCR、Western blot和流式细胞术结果显示，BEL7402-HBx，BEL7402-MHBs(t)细胞和对照组细胞相比，TRAIL受体在mRNA水平和蛋白质水平的表达均无显著性差异(P>0.05)。 2)胞浆凋亡通路水平：10ng/mL TRAIL作用下，BEL7402-HBx、BEL7402-MHBs(t)细胞中caspase 3、9的活化水平显著高于对照组细胞，而caspase8和Bid的活化水平无显著性差异。各组细胞FLIP mRNA、FLIP蛋白质和BaxmRNA的表达无显著性差异(P>0.05)，但BEL7402-HBx细胞Bax蛋白的表达显著高于其他组细胞(P<0.01)。 3．小干扰RNA封闭Bax的表达可逆转HBx对TRAIL诱导凋亡的上调效应 3．1阳性对照小干扰RNA载体可有效抑制GAPDH基因的表达 成功构建阳性对照载体pGAPDH-Si和无关序列对照载体pContr01-Si，转染BEL7402-HBx细胞，RT-PCR检测结果显示，pGAPDH-Si转染组内参照基因GAPDH mRNA的表达显著低于对照组细胞(P<O.01)。 3．2 pBax382-Si可有效阻断BEL7402-HBx细胞中Bax的表达 成功构建Bax小干扰RNA载体pBax172-Si和pBax382-Si，转染BEL7402-HBx细胞，半定量RT-PCR、荧光定量RT-PCR和Western blot检测结 果显示，pBax382-Si转染组细胞与其他组细胞相比，Bax mRNA水平和蛋白质水平的表达均显著降低(P<0.01)。 3.3小干扰RNA阻断Bax的表达可逆转HBx对TRAIL诱导凋亡的上调效应 TUNEL流式细胞术结果显示，pBax382-Si和TRAIL共同作用的BEL7402-HBx细胞与对照组相比，凋亡率显著下调(P<0.05)，接近但略高于相同浓度TRAIL作用下BEL7402细胞的凋亡率。 3.4小干扰RNA阻断Bax的表达对TRAIL凋亡通路分子活化水平的影响 Western blot结果显示，pBax382-Si和TRAIL共同作用的BEL7402-HBx细胞与对照组相比，caspase 3，9的活化水平显著降低，但caspase 8和Bid的活化水平无显著性变化。 4．HBx在小鼠肝细胞中的表达促进TRAIL腺病毒诱导的肝细胞凋亡 4.1体外成功扩增TRAIL腺病毒并验证其生物学活性 体外大量扩增TRAIL腺病毒，空斑形成试验测定病毒滴度为5×10<'11>pfu/mL。以不同滴度作用于BEL7402细胞，MTT结果显示，TRAIL腺病毒作用组细胞的生长抑制率显著高于空载体腺病毒作用组(P<0.05或P<0.01)。 4.2 HBx基因在小鼠肝细胞内成功表达 尾静脉水压注射法注射pcDNA-HBx，48h后，RT-PCR可检到小鼠肝组织内有明显的HBx mRNA的表达，Western blot可检测到低水平HBx蛋白的表达，而在对照组肝组织未检测到表达。 4.3 HBx在小鼠肝细胞中的表达促进TRAIL腺病毒诱导的肝细胞凋亡 PI流式细胞术检测结果显示，HBx与TRAIL腺病毒共同作用组小鼠肝组织凋亡率显著高于对照组小鼠(P<0.01)，血清谷丙转氨酶水平和肝组织病理切片进一步证实HBx的表达可促进TRAIL腺病毒介导的肝脏损伤。 结论： 1.利用硫代反义寡核苷酸封闭HBx、HBpreS2的表达可下调HBV全基因转染细胞HepG2.2.15对TRAIL诱导凋亡的敏感性，初步筛选出HBx、HBpreS2 可能参与HBV影响TRAIL诱导凋亡的过程。 2.HBx、MHBs(t)真核表达载体在肝癌细胞BEL7402中的稳定表达，可提高其对TRAIL诱导凋亡的敏感性，证实HBx、MHBs(t)具有促进TRAIL诱导凋亡的生物学活性。 3．HBx、MHBs(t)的表达不影响BEL7402细胞表面TRAIL受体和胞浆FLIP蛋白的表达水平，但可提高TRAIL传导通路中caspase 3，9的活化水平。研究 发现，HBx的表达可提高Bax蛋白的表达。 4．小干扰RNA封闭Bax基因的表达，可逆转HBx对TRAIL诱导凋亡敏感性的影响，反向证实HBx通过上调Bax表达影响TRAIL诱导的凋亡。 5．体内实验进一步证实，HBx在小鼠肝细胞中的表达可提高TRAlL腺病毒介导的肝脏损伤。 创新点及意义： 1．本研究分别通过建立稳定转染肝癌细胞模型和硫代反义寡核苷酸封闭的方法，正、反向论证了HBV基因片段在影响TRAIL诱导凋亡中的作用，并率 先报道了HBx、MHBs(t)的表达可上调肝癌细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，筛选出参与影响TRAIL诱导凋亡的HBV基因片段，并提出二者在相关疾病 发生过程中的新的作用机制。 2．本研究从TRAIL凋亡通路的胞膜受体水平、胞浆凋亡通路水平及线粒体依赖途径和线粒体非依赖途径，深入探讨了HBx、MHBs(t)影响TRAIL诱导凋亡的分子机制，提出二者可能通过调节线粒体依赖途径凋亡信号的传导来影响 TRAIL诱导的细胞凋亡。 3．利用小干扰RNA技术封闭Bax基因的表达，从反向进一步证实HBx可能通过提高Bax的表达水平来影响TRAIL诱导的细胞凋亡，为HBx参与调节细 胞凋亡的机制提出了一个新的论点。 4．应用尾静脉水压注射法，在小鼠肝细胞内表达HBx基因，并在体内进一步证实HBx的表达可上调TRAIL诱导的肝细胞凋亡，为HBx基因功能的体内研 究建立了一种有价值的实验模型。