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摘要鳗弧菌是危害我国水产养殖业的主要病原菌。本文采用分子生物学,免疫学和膜片钳等技术,研究养殖鱼类大菱鲆(scophthalmus maximus),在受到病原菌感染后,snare蛋白和钾离子通道参与免疫应答防御机制的调控作用。通过腹腔注射半致死剂量的鳗弧菌,研究受感染的大菱鲆在感染初期所诱发的一系列应激反应。通过鉴定外周血液白细胞的吞噬和杀灭鳗弧菌的活性,以及外周血、脾脏和头肾白细胞所发生的呼吸爆发的活性,血清中细胞因子一白介素1 β的含量的变化,研究抗鳗弧菌的先天性免疫应答防御机制。结果发现在感染24hr后,白细胞吞噬鳗弧菌的百分数从47.25[％]增加到61.18[％],吞噬鳗弧菌的指数从4.68增加到5.62;杀菌活性从1.26增加到1.73;呼吸爆发活性od600值从0.07增加到0.2;比较外周血、脾脏和头肾白细胞三种组织所发生的呼吸爆发的活性发现,脾脏白细胞的呼吸爆发活性最高,头肾略高于血液,感染8hr后呼吸爆发活性平均大于1.7;血清中细胞因子一白介素1 β的0d490值从正常鱼对照的0.0523±0.014增长到感染24hr的最大值0.47±0.033,感染24 hr后的表达量大约是未感染对照的9倍,感染后增加量显著(p<0.05)。进一步证明感染初期先天性免疫应答防御在保护鱼体中的重要作用。 snare蛋白是一种参与调控所有真核生物细胞分泌和胞吐的膜蛋白。为了测定snare蛋白是否也参与大菱鲆白细胞的分泌和胞吐,首先通过rt-pcr方法鉴定大菱鲆体内存在的snare蛋白,设计两种snare蛋白(v-snare,vamp-2和t-snare,snap-25)基因的引物,从外周血白细胞和脑组织中都克隆出snares蛋白中的vamp-2的cdna,而snap-25的cdna仅从脑组织中克隆出。经过序列分析发现,大菱鲆的vamp-2基因与多数哺乳动物的vamp-2基因同源性在80[％]以上,而氨基酸序列的同源性在90.6[％]以上;大菱鲆snap-25基因与多数哺乳动物的snap-25基因也在83[％]以上,氨基酸序列的同源性在89[％]以上。结果表明这两种snare蛋白在大菱鲆体内也是非常保守。为了证明snare蛋白是否参与调控大菱鲆白细胞细胞因子白介素-1 β的分泌,研究分泌调控蛋白-snares在大菱鲆先天性免疫应答过程中的作用。通过rt-pcr,免疫印迹,免疫组化技术克隆了大菱鲆vamp-2基因,并研究了其在细胞因子白细胞介素-1 β分泌中的调控作用。 证明VAMP-2蛋白存在于大菱鲆外周血白细胞内，其核苷酸序列与斑马鱼和鲈鱼的同源性分别为88.2％和93.O％。受鳗弧菌感染后，大菱鲆VAMP-2蛋白在转录和翻译水平都显著增加，并且在时间上和表达量上与IL-1β分泌一致。以上结果证明VAMP-2在鱼类免疫细胞因子IL-lβ的分泌和先天性免疫应答调控中的重要作用。淋巴细胞是直接参与获得性免疫应答的重要效应细胞。淋巴细胞膜上存在许多离子通道，参与调控钙离子动态平衡和信号传导。其中钾离子通道在调控T淋巴细胞的钙离子信号，淋巴细胞的分化、增殖、激活免疫应答方面起关键作用。因此，利用膜片钳技术记录了大菱鲆外周血淋巴细胞上钾离子通道在受到鳗弧菌感染前后的变化，并通过应用钾离子通道阻断剂，检测增殖淋巴细胞的变化，研究钾离子通道在获得性免疫应答过程中的作用。结果发现，通过施加钾离子通道阻断剂，证明记录到的是钾离子通道电流；并观察到淋巴细胞增殖受到抑制；在受感染的情况下，通过钾离子通道的电流幅度增加，说明钾离子通道的的激活和开放与淋巴细胞增殖和启动特异性免疫应答过程有关。