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摘要脊髓损伤(Spinal cord injury，SCI)作为一种致残率很高的中枢神经系统疾病，其治疗目前仍是医学领域一个棘手的问题。已有大量研究证实了单独的骨髓基质细胞(Bone Marrow Stromal Cells，BMSCs)和嗅鞘细胞(Olfactory ensheathingcells，OECs)移植对SCI的修复具有促进作用，但由于它们自身特性的限制，单独移植后能成功再生的轴突数目较少、距离较短，而且功能恢复的程度也不令人满意。为此，本实验首次将BMSCs和OECs联合移植于大鼠全横断的脊髓断端处，利用BMSCs具有多向分化潜能，移植后能产生细胞的多样性，在脊髓损伤区的微环境中可进行分化而替代或补充损伤神经细胞的特点，和OECs具有促进损伤神经轴突再生并穿越胶质屏障和分泌神经营养因子改善局部微环境的特点，借助于细胞问的相互作用，取长补短，综合二者优势，以期从结构和功能上改善对SCI的修复，为SCI的治疗提供新的思路，找出更佳的SCI修复手段。查阅文献，目前国内外尚未发现此类报道，由于BMSCs具有来源丰富，取材方便，可自体移植，不涉及伦理道德和免疫排斥方面的问题，OECs也可从自身鼻粘膜固有层活体取材获取，如本研究获成功，将具有重要的理论意义和广阔的应用前景。 本实验分为以下四部分，主要内容和结果如下： 1．骨髓基质细胞的体外培养及鉴定： 采用贴壁筛选法对取自成年S-D大鼠股骨和胫骨的BMSCs进行分离培养，并用细胞免疫荧光方法对BMSCs进行鉴定，观察到经4～5次传代的BMSCs都表达间充质干细胞标记物Vimentin，空白对照未见免疫荧光着色，细胞纯度较高，可用于移植研究。 2．嗅鞘细胞的体外培养、纯化和鉴定： 将取自成年S-D大鼠嗅球的OECs进行分离培养，采用差速贴壁法和化学抑制法对OECs进行纯化，并用细胞免疫荧光方法对OECs进行鉴定，结果显示：绝大部分细胞呈p75阳性，空白对照未见免疫荧光着色，通过计算其纯度约为85％左右，可用于移植研究。 3．骨髓基质细胞和嗅鞘细胞体外联合培养的观察： 将纯化后的BMSCs及OECs按1:1比例混合后进行体外培养，发现联合培养的BMSCs和OECs在体外能够很好的共同生长；分别用p75、Vimentin和Nestin的免疫荧光染色对联合培养细胞进行观察，结果显示：一部分细胞呈p75阳性，另一部分呈Vimentin阳性，Vimentin阳性细胞形成的细胞簇中央的细胞表达神经干细胞标记物Nestin，提示通过BMSCs和OECs间的相互作用，能激活BMSCs向神经系细胞分化的潜力。 4．骨髓基质细胞和嗅鞘细胞联合移植对脊髓全横断损伤的修复作用： 建立成年S-D大鼠T10脊髓全横断模型，2周后将体外培养纯化的BMSCs和OECs分别用CFDA．SE和Brdu标记后，植入脊髓损伤处。按治疗手段的不同，将实验大鼠随机分为以下四组：BMSCs移植组、OECs移植组、BMSCs+OECs联合移植组以及空白对照组。采用BBB评分和爬网格试验对大鼠后肢运动功能进行评价；移植术后8周，通过辣根过氧化物酶(Horseradish peroxidase，HRP)逆行示踪技术计数标记的中脑红核神经元数目来评价移植细胞对神经元的逆行保护作用；通过损伤区空洞和瘢痕面积测量、嗜银染色神经纤维线密度测量、NF200免疫组化染色平均灰度值测定等手段来评价移植细胞对损伤脊髓的保护和修复作用以及对神经纤维再生的影响。结果显示：BMSCs+OECs联合移植组的大鼠后肢运动功能改善较单细胞移植组早且明显，4-8周时的BBB评分与其余各组相比均差异显著；移植后8周，除对照组外，其余各组均可在注射位点及其邻近区域见到较多的荧光标记的移植细胞，呈散在分布于整个损伤区附近；HRP逆行标记的中脑红核神经元数目BMSCs+OECs联合移植组>OECs移植组>BMSCs移植组>空白对照组；损伤区空洞和瘢痕面积空白对照组>BMSCs移植组及OECs移植组>BMSCs+OECs联合移植组；神经纤维线密度BMSCs+OECs联合移植组>BMSCs移植组及OECs移植组>空白对照组；NF200平均灰度值空白对照组＞BMSCs移植组及OECs移植组＞BMSCs+OECs联合移植组。 本实验结果首次表明BMSCs和OECs体外联合培养可促进BMSCs向神经系细胞分化；BMSCs和OECs联合移植可促进SCI大鼠的运动功能恢复；能减少损伤区空洞和瘢痕的形成；对中脑红核运动神经元具有逆行保护作用；可促进损伤脊髓轴突再生和神经通路的重建。联合移植对SCI的治疗作用优于单一类型细胞移植。采取BMSCs和OECs联合移植方式可综合二者优势，使移植的细胞具有功能多样性，弥补了单一细胞类型移植的缺陷或不足，为临床SCI的治疗提供了新的思路和方法。