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摘要[目的] 制备组织工程骨(BCBB/BMP/bFGF/MSCs)和微波灭活兔股骨头坏死模型，模拟临床上开窗减压植骨术治疗股骨头坏死的过程，移植该组织工程骨修复兔股骨头坏死，评价其对股骨头坏死的成骨和成血管性能及其修复效果，为进一步研究提供实验依据。 [方法] 本研究分为四个部分。 第一部分，微波灭活兔股骨头坏死模型的建立。成年新西兰大白兔48只96侧股骨头，将微波天线插入股骨头灭活，根据微波灭活的不同温度和时间随机分为4组，每组24侧股骨头。A组：50℃、10min；B组：55℃、10min；C组：55℃、20min：D组：60℃、10min。分别于术后即刻、1w、2w、4w、8w和12w取材，每个时间点每组取材4侧股骨头，采用x线、MRI和组织学观察坏死和修复情况，确定最佳灭活温度和灭活时间。 第二部分，双相陶瓷生物骨(Biphasic ceramic biologic bone，BCBB)的制备。 取新鲜市售猪椎骨制成一侧含皮质骨的松质骨条，先用低温煅烧的方法制备出陶瓷化骨(True bone ceramic，TBC)，再将TBC与焦磷酸钠溶液(Na<,4>P<,2>O<,7>.10H<,2>O，NP)复合后低温煅烧，制得主要成分为羟基磷灰石(Hvdroxvapatite，HA)和磷酸三钙(Tricalcium phosphate，TCP)的BCBB。进行扫描电镜观察、材料成分分析、抗压强度测试。 第三部分，双相陶瓷生物活性骨(BCBB/BMP/bFGF)的制备及细胞相容性研究。将有骨诱导活性和成血管性能的骨形态发生蛋白(Bone morphogeneticprotein，BMP)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)与BCBB复合。分离培养兔骨髓基质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)。取密度为1×10<'6>/mL的第三代MSCs与双相陶瓷生物活性骨复合培养，采用倒置相差显微镜、扫描电镜(Scanning electron microscope，SEM)观察以及细胞增殖曲线检测。 第四部分，组织工程骨修复兔股骨头坏死模型的实验研究。成年新西兰大白兔32只，建立兔双侧股骨头坏死模型(方法同第一部分，微波加热55℃、10min)，8w时按造模时的手术入路，刮除股骨头50[％]左右松质骨，将32只兔64侧股骨头随机分为4组，每组16侧股骨头。A组：空白缺损；B组：植入双相陶瓷生物活性骨(BCBB/BMP/bFGF)；C组：植入组织工程骨(BCBB/BMP/bFGF/MSCs)；D组：植入自体松质骨。分别于术后2w、4w、8w和12w取材，每个时间点每组取材4侧股骨头，进行大体标本观察、X线摄片、组织学、CD<,34>免疫组化染色、钙含量及钙磷比检测等。所有数据采用SPSS 11.5统计软件包进行分析处理，采用单因素方差分析，以a=0.05作为差异有显著性的标准。观察骨修复情况和再血管化情况，评价组织工程骨BCBB/BMP/bFGF/MSCs对股骨头坏死的修复潜能。 [结果] 实验结果显示： 第一部分 (1)大体解剖观察。A组：术后各时间点，股骨头软骨及大体解剖观察未见异常。B组：术后8w冠状面上可见局部骨质疏松，术后12w有3侧股骨头塌陷。C组：术后8w所有股骨头塌陷。D组：术后4w有1侧股骨头塌陷，术后8w所有股骨头塌陷变形。(2)X线摄片。A组：术后各时间点，股骨头未见异常。 B组：术后4w股骨头开始出现囊性变。C组：术后2w股骨头开始出现低密度改变。D组：术后1w股骨头开始出现低密度改变。(3)MRI。A组：术后4w股骨头T<,1>相出现低信号改变，术后8w股骨头信号改变恢复正常。B组：术后2w股骨头开始出现T<,1>相信号减低、T<,2>相信号增高区。C组：术后1w T<,1>相股骨头开始出现低信号改变，T<,2>相信号增高。D组：术后1w T<,1>相股骨头开始出现低信号改变和囊性变，T<,2>相信号增高。(4)组织学观察。A组：术后1w部分骨髓组织凝固变性，术后8w坏死骨小梁及骨髓组织完全吸收。B组：术后1w骨髓组织凝固变性，术后4w股骨头坏死与修复同时进行，术后12w骨修复停止，骨坏死继续，软骨细胞及软骨基质减少，软骨组织皲裂。C组：术后即刻骨髓组织凝固变性，术后12w骨坏死继续，软骨母细胞增生，软骨组织层次不清。D组：术后即刻骨髓组织凝固变性，术后12w骨坏死继续，软骨细胞及软骨基质减少，软骨组织层次不清。 第二部分BCBB呈白色，表面粗糙，孔径范围462±123/μm，孔隙率为(59.5±2.5)％，BCBB主要由79.1％羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)和17.4％磷酸三钙(Tricalcium phosphate，TCP)组成。BCBB的钙磷原子数量比为1:1.59±0.11。抗压强度应为(3.30±0.68)Mpa。BCBB中蛋白含量为0，有机成分已完全被去除。 第三部分 BMP、bFGF有效地复合到了双相陶瓷生物骨(BCBB)上，制备成双相陶瓷生物活性骨(BCBB/BMP/bFGF)。双相陶瓷生物活性骨具有较好的细胞相容性，MSCs能在其表面和孔隙内黏附生长、增殖。第6天时，MSCs与双相陶瓷生物活性骨联合培养细胞增殖达稳定期，构建了理想的组织工程骨，此时为该组织工程骨移植的最佳时机。 第四部分 (1)股骨头大体及解剖观察。A组(空白缺损组)：8w和12w各有1侧股骨头塌陷。B组(BCBB/BMP/bFGF组)：2w时开始纤维结缔组织生长活跃。C组(BCBB/BMP/bFGF/MSCs组)：2w时开始纤维结缔组织生长活跃，12w时植骨区与宿主骨界限不清。D组(白体松质骨组)：12w时骨移植区与宿主骨界限不清。 (2)X线摄片。A组2w时骨移植区呈低密度影。B组和C组2w时骨移植区呈高密度影。D组2w时骨移植区密度与宿主骨相当。x线评分：12周时，B组、C组、D组优于A组(p<0.05)，B组、C组、D组间无统计学差异(p>O.05)。 (3)组织学观察。A组(空白缺损组)12w时缺损区只有少量类骨组织形成。B组(BCBB/BMP/bFGF组)8w时大量新骨形成，12w时BCBB吸收不全。C组(BCBB/BMP/bFGF/MSCs组)4w时成骨前体细胞和成骨细胞较多，未见炎症细胞浸润，8w时大量新骨形成，12w时。BCBB吸收不全，股骨头软骨层软骨细胞丰富，软骨基质均匀。D组(自体松质骨组)8w时移植物已完全吸收，12w时骨改建已基本完成。新骨形成面积比较：12w时C组优于B组且具有统计学差异(p<O.05)，C组、D组间无统计学差异(p>O.05)。 (4)x射线能谱钙含量及钙磷比检测。由于BCBB较自体松质骨吸收缓慢，2w、4w、8w时B组、C组钙含量及钙磷比大于D组，与D组间比较具有显著性差异(p<O.05)。 (5)血管计数和血管面积。2w、4w和8w时血管计数和血管面积显示，A组血管数和血管面积最少，D组次之，B组、C组较多。B组、C组间比较无统计学意义(p>0.05)；但B组、C组与A组、D组比较具有统计学意义(p<0.05)。表明bFGF的再血管化作用。 (6)新骨形成面积与新生血管面积相关性分析。4w、8w时新骨形成面积与新生血管面积呈正相关(p<0.05)。表明bFGF通过刺激毛细血管生长促进新骨形成。 [结论](1)该研究首次采用微波灭活建立股骨头坏死模型，该造模方法具有动物死亡低，坏死成功率高，灭活温度和时间容易精确控制，可重复形大，操作简便等优点。但微波所致股骨头坏死与临床股骨头坏死的病因和病理机制不同，该方法只适合模拟临床上开窗减压植入治疗早期股骨头坏死的实验研究，而不能用于股骨头坏死的病因和病理机制研究。50℃、10min只能够导致兔股骨头发生局部坏死，而且能够自行修复，故50℃、10min不宜作为制作兔股骨头坏死模型的适宜温度和时间。而采用55℃、10min时显示，术后1w股骨头开始坏死，术后4w股骨头坏死与修复同时进行，术后8w骨修复停止，术后12w股骨头塌陷率为75％，若在股骨头停止修复和塌陷前促进其修复、防止其塌陷，就能够以此为模型，进行股骨头坏死的保头治疗研究。因此55℃、10min可以作为制作兔股骨头坏死模型的适宜温度和时间。由于55℃、20min和60℃、10min的时间过长、温度过高，骨杀伤的程度和范围过大，不宜作为制作兔股骨头坏死模型的适宜条件。 (2)通过低温煅烧的方法可以制备出BCBB，BCBB具有天然的网孔结构，有机成分被完全去除，并具有一定强度，BCBB有望作为骨组织工程支架材料。 (3)BMP、bFGF有效地复合到了双相陶瓷生物骨(BCBB)上，制备出双相陶瓷生物活性骨(BCBB/BMP/bFGF)。双相陶瓷生物活性骨具有较好的细胞相容性，MSCs能在其表面和孔隙内黏附生长、增殖。第6天时，MSCs与双相陶瓷生物活性骨联合培养细胞增殖达稳定期，形成理想的组织工程化骨(BCB/BMP/bFGF/MSCs)，此时为该组织工程骨移植的最佳时机。 (4)组织工程骨BCBB/BMP/bFGF/MSCs移植修复兔股骨头坏死模型，生物相容性较好；12w时BCBB吸收不完全，假如BCBB移植不在股骨头这样的承重部位，可以增加TCP的含量从而加快材料降解速度；BMP能够诱导未分化MSCs向软骨母细胞和骨母细胞分化，促进新骨形成；bFGF对已分化的MSCs具有促增殖作用，同时能够刺激毛细血管向移植物内长入，为骨组织修复提供营养，促进骨修复；组织工程骨BCBB/BMP/bFGF/MSCs对兔股骨头坏死的修复效果优于BCBB/BMP/bFGF，与自体松质骨移植相当。假如其细胞免疫和体液免疫等方面得到进一步探讨，则有望为临床上成人股骨头坏死的保头治疗提供一种有效的途径。