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摘要目的丙型肝炎病毒(HCV)感染是慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌的主要原因，已成为全球性的公共卫生问题。HCV 5'端非编码区(5'NCR)含内部核糖体进入位点(IRES)，以非帽依赖机制介导着-HCV基因翻译，且碱基序列高度保守，因此HCV 5'NCR是抗HCV药物筛选的主要靶位点。本实验旨在构建一系列含有HCV 5'NCR 5'端梯度缺失序列调控萤火虫荧光素酶(luc)报告基因的真核表达质粒，以分析影响HCV 5'NCR的翻译启动活性的功能序列，为进一步研究HCV IRES的结构与功能提供实验和理论依据。 方法以pCMVNCRluc(以下简称pCNI)为模板，PCR 扩增获得一系列HCV 5'NCR 5’端梯度缺失序列，然后利用基因重组技术，用这些序列分别替换pCNI中的完整HCV 5'NCR，构建HCV 5'NCR5，端梯度缺失序列调控luc的真核表达质粒pCNl-d1、pCNl-d2、pCNl-d3、pCNI-d4；同时。PCR扩增缺失所有HCV序列的模板片段，构建无HCV 5'NCR片段的luc真核表达质粒pCNI-d5；各重组质粒经酶切和DNA测序鉴定；用脂质体介导基因转染技术，将上述重组质粒及pCNl转染至人肝癌细胞株HepG2；转染后48h用双荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶相对活性以分析5'NCR 5'端梯度缺失序列对luc基因的调控作用，并经RT-PCR检测转染细胞中luc基因的相对表达水平观察luc基因在转录水平有无不同。 结果PCR扩增分别获得5'端缺失ntl-20,ntl-43,ntl-118和ntl-330的HCV 5'NCR片段，及缺失所有HCV序列的模板片段；经酶切和测序鉴定表明HCV 5'NCR 5'端梯度缺失序列调控luc的真核表达质粒pCNl-dl、pCNl-d2、pCNI-d3、pCNl-d4和无HCV 5'NCR片段的luc真核表达质粒pCNl-d5构建成功；各重组质粒转染细胞后luc mRNA的相对表达水平与pCNl相比差异无统计学意义(P>0.05)：pCNl-d1、pCNl-d2表达的荧光素酶活性与pCNl差异无显著性(P>0.05)，pCNl-d3与pCNl-d4的荧光素酶活性与空白对照差异无显著性(P>0.05)，pCNl-d5的荧光素酶相对表达活性为pCNl的70％。 结论 成功构建了由HCV 5'NCR 5’端梯度缺失序列调控luc表达的质粒pCNl-dl、pCNl-d2、pCNl-d3、pCNl-d4和无HCV 5'NCR片段的luc真核表达质粒pCNl-d5；在本实验条件下，HCV 5'NCRnt44-407序列具有全部翻译启动活性，nt44-118(结构域II)含有影响HCV IRES翻译启动活性的关键序列。