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摘要随着经济发展和生活水平的提高，心力衰竭在心血管事件的发生率和病死率中所占的比例越来越高。目前研究的主要进展在于其分子生物学机制，特别是心衰早期的共同临床特征：左室的肥厚性重构。左室肥厚的主要特征是心肌细胞在形态上的扩展和蛋白合成的增加以及胚胎基因程序的激活。传统观点认为，心肌肥厚是心脏负荷增加时室壁应力正常化的一种适应性改变，但是却是猝死、心肌梗死和充血性心力衰竭的独立危险因素，而且肥厚的心脏更易于发生心肌缺血和再灌注损伤；所以心肌肥厚并非完全有利。目前对心肌肥厚的研究主要集中在神经内分泌调控和对循环功能的影响，有关肥厚心肌结构和能量代谢的研究相对较少。传统的药理学治疗目标也是针对肥厚前途径，如血管紧张素转换酶(．ACEI)、β受体阻滞剂，可以从本质上减轻肥厚但不能彻底逆转肥厚。基于这几点，探索抑制心肌肥厚的其它有效措施很有必要，即研究肥厚特异性作用机制与肥厚形成机制同样重要。在分子生物学领域，长期以来人们致力于研究正性介导心肌肥厚的信号转导途径，对负性调节机制的研究还很不充分，而越来越多的证据表明负性调节心肌肥厚的信号途径同样应该引起重视。某些内源性分子已经被证实可以负性调节心肌肥厚，即这些分子水平上调可以抑制心肌肥厚，下调则刺激肥厚产生，如蛋白激酶B(PKB/Akt)/糖原合成酶激酶途径(GSK-3β)途径。GSK-3β属于保守丝氨酸/苏氨酸激酶家族，这一酶家族存在于所有真核生物中，包括两种α、β两种亚型，在心脏中均有表达；迄今为止大部分研究都是探讨GSK-3β的作用，因其不但是重要的肥厚负性调节信号分子，同时对心肌细胞凋亡有重要的调节作用。Melusin是一个新发现的肌肉组织特异性蛋白，广泛表达于心肌和骨骼肌组织，其作用于整合素(integrin)细胞质表型并结合于β1整合素胞浆区域，于横纹肌特异性 表达，存在于心肌细胞肋状体。Melusin的活化对心肌肥厚有益，它的作用相当于整合素途径的生物力学感应器，对压力负荷过重产生的负性效应有保护性作用。Akt编码丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，它出现在与心脏功能和心脏疾病有关的各种刺激和效应器之间的重要位置，Akt过度表达不引起MAPKs的激活，所以Akt被认为是介导生理性肥厚的重要递质。Gaq过度表达致心肌肥厚模型是模拟内源性α肾上腺能介导的心肌肥厚，与神经体液激活有关与机械牵张刺激无关，而主动脉结扎致心肌肥厚模型则是模拟压力负荷过重致心肌肥厚机制，本研究旨在通过对不同心肌肥厚动物模型中melusin/integrin/Akt/GSK-3β信号转导途径各关键酶的表达研究，探讨此结构蛋白与代谢基因整合信号途径的作用机制，从而对今后临床的治疗方向提供一些有益的帮助。 实验材料与方法 一、实验材料 1．实验动物： 主动脉结扎组：雄性Wistar大鼠40只，4周龄，体重80-100克，随机分为主动脉结扎组和对照组，各20只，由德国洪堡大学Charite医学院心血管病研究所动物室喂养，喂食专用颗粒饲料，随意饮水。 Gaq过度表达组：转基因Gaq过度表达FVB/N小鼠(n=17)及对照组野生型小鼠(n=14)，12周龄，由科隆大学生理学教研室提供。 二、实验方法 1．主动脉结扎致左室肥厚模型的建立：水合氯醛(400mg/Kg)腹腔麻醉，小动物呼吸机辅助呼吸，开胸，剥离升主动脉，钽制夹(内径0.5lmm)放置于主动脉瓣上0.5-1cm升主动脉处，关胸，待大鼠恢复自主呼吸后，拔掉气管插管，正常饮食笼装饲养。假手术对照组大鼠处理方法相同，但不放置钽制夹。四周后观察各项指标。 2．超声心动图及血流动力学测定 15-MHz探头(Acuson Sequoia，Germany)于二维短轴和长轴切面观测左心室，M超测量室间隔(IVS)、左室后壁(INPW)厚度以及左心室舒张(LVEDD)和收缩末(INESD)内径，计算射血分数。PES0导管测定心率(HR)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LEVDP)和左室压最大上升、下 降速率(dP/dt<,max>&dP/dt<,min>)，同时行股动脉插管记录动脉压。记录血流动力学指标后，以10％KCL2-3ml股静脉注射处死各观察终点大鼠，分离心脏，分离左心室，称重，部分置于4％多聚甲醛中固定。其余于液氮中速冻,储存于-80℃。围手术期的主动脉结扎组大鼠死亡1只。 3．RT-PCR： 采用TRIzol RNA一步法提取心肌组织RNA，按MMLV改良Super-script<'TM>Ⅲ platinum<'R>一步法(Invitrogen公司)RT-PCR，引物设计应用Dna-sis version 2.2和Primer Express软件(PE Biosystem)进行引物设计：melusin(149bp)：上游引物：5’-GGA GCA GGA CrlT GAC AAT AG-3’，下游引物：5’-CAC TCT CAG GAC CTr GGT AA-3’；integrin a7(125bp)：上游引物：5’-TGA CCT TGA GGT GGA CAC TA-3’，下游引物：5’-CAGTCA GAG TGG CAC ATC TT-3’；integrinβ1(140bp)：上游引物：5’-CTCAAG AGC GGA GAA TAG-3’下游引物：5’-ATC TGT CCA CCA GTACTT-3’；GAPDH(209bp)：上游引物：5’-CAT GCC ATC ACT GCC ACTCA-3’，下游引物：5’-GCG GCA TGT CAG ATC CAC AA-3’。反转录反应应用RT-PCR反应试剂盒。Reahime PCR：应用TAQ MAN 7700行Reahime PCR定量测定melusin、integfina7、integrinβ1表达，GAPDH对照。 4．蛋白提取和免疫印迹杂交(western blotting) 心肌组织于冷冻的提取缓冲液(1：3wt/vo1)(成分：10mM Tris HCl，pH7．5，140mMNaCl，lm MEDTA，25％Glycerol，0.5％SDS，0.5％Noni-dent P-40，0.1 mM PMSF，100ng/ml Protease inhibitor cocktail)中行均质化处理(30 sec．2000rpm)，离心(4℃，lOmin，14，000rpm)，Bio-Rad蛋白分析仪(Bio-Rad company，USA)测量上清液蛋白浓度，液氮速冻保存于-80℃。10％SDS-PAGE分离10-20ug蛋白于硝酸纤维素膜行蛋白印迹杂交。Melusin，set473-AKT和AKT抗体(New England Biolabs)，CSK3β(BDBiosciences)和Phospho-S9-GSK3β(Aeris Antibodies)抗体按说明书推荐方法检测。应用二抗特异性HRP-conjugated抗体，其信号用ECL detec-tion kit(Amersham Pharmacia Biotech)显示，AlphaEaseFC Software处理并量化统计。为标准化不同的蛋白含量，我们利用剥脱液(stripping buffer：1．87g glycin/1L，100ml10％SDS/1L，pH=2)剥脱原始抗体复合物并用GAP-DH(primary antibody：Chemicon，MAB-374，1：5000；secondary antibody：Donkey anti-mouse，Dianova，1：50，000)再杂交。Sigma Plot8.0软件分析 各条带与GAPDH的比值。 5．免疫组化 采用抗生物素-生物素-过氧化物酶复合物法(ABC)。试剂盒由AK－Dihent(Antibody Diluent，Chem Mate．TM)提供，石蜡切片常规脱蜡至水，3％的过氧化氢封闭，微波抗原修复20min，血清封闭，Avidm 15rain，PBS洗3×2min，Biotin 15min，PBS洗3×2min；滴加用AK-Diluent 1：10倍稀释的melusin一抗(兔抗)孵育60min，PBS洗2x3 min，滴加1：50稀释的二抗孵育30rain，PBS洗2×3 min，DAB显色，镜下控制反应时间，双蒸水终止反应，苏木素轻度复染，脱水、透明、封片，显微镜观察。用PBS液代替一抗作为阴性对照。判定标准：免疫组化染色以细胞中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。 6.统计学方法 所有数据采用均数±标准差( ±s)表示，均值比较采用t检验，统计学计算采用Excel，Sigma Plot和SPSS软件。P<0.05为有统计学意义。 结 果 1．血液动力学特征：主动脉结扎组与假手术组比较，SBP呈非常显著增高(112.7±3.6 vs 93.5±3．9，P<0.01)；LVEDP明显升高(10.3±2.0 vs3.5±1.8，P<0.05)；Dp/dtmax明显降低(3508±310 vs 4675±322，P<0.05)；CVP则无显著性差异。Gaq过度表达组血压则无明显变化，收缩和舒张末内径则明显升高(2.5±1.0 vs 1.7±1.0；4.5±1.0 vs 3.4±2.0；P<0.05)，Dp/dtmax明显降低(4557±468 vs 43077±653，P<0,01)。 超声心动图特征：主动脉结扎组与假手术组比较，IVS和LVPW明显增厚约60％(P<0.01)；LV－FS也明显增加(32.0±2.0 vs 49.8±1.0％，P<0.05)，LV-EF虽然数量有所增加，但无统计学差异。LVEDD和LVESD在两组间无明显差异。Melusin mRNA基因表达与LVEF呈正相关(r=0.537，P<0.05)，与LVEDD呈负相关(r=-0.820，P<0.01)；Gaq过度表达组IVS和LVPW未见明显增厚，但左室重量明显增加(90±3.0 vs 65±4.0，P<0.05)，LV-FS则明显降低(32±2.0 vs 50±1.0，P<0.05)，LV-EF无统计学差异。 2．体重、左室重量及左室肥厚指数：主动脉结扎组与假手术组比较，心 脏和左室重量增加非常显著，p<0.01；左室肥厚指数显著增加，接近对照组的两倍，p<0.05。Gaq过度表达组心脏及左室重量、左室肥厚指数也明显增加(p<0.05)。 3．Real．time PCR检测：主动脉结扎组melusin(186±14％)、integrinα7(286.7±18.2％)，integrinβ1(355.1±34.4％)mRNA表达均较对照组明显升高(p<0.05)；Gaq过度表达组与对照组无明显差异。 4．Western blotting检测：以GAPDH作为标准化对照，主动脉结扎组磷酸化Akt的比率明显升高(130±9％，p<0.05)；磷酸化GSK3β的比率明显降低(78±3％，p<0.05)，Melusin蛋白水平表达在主动脉结扎组表达明显升高(280±51％，p<0.01)；Gaq过度表达组仍无显著性差异。 5．免疫组化染色定位结果：melusin在心肌细胞的胞膜间质周围区域表达 许多流行病学研究显示，肥厚的延长会导致心血管事件死亡率的增加。这一临床证据显示，肥厚过程并非完全有利。细胞信号转导系统具有调节细胞增殖、分化、代谢、适应、防御和凋亡等多方面的作用，它们的异常与多种疾病相关。G蛋白耦联受体(GPCR)家族Gaq通路和P13K/Akt/GSK3β信号通路均为膜受体通路，由于细胞的受体数量要远远多于细胞内的信号转导通路，故有不同受体共用信号转导通路的现象，不同膜受体激活的信号转导通路之间以及膜受体和作为转录因子的核受体信号通路间具有相互联系和作用，虽然二者在细胞内信号转导通路各不相同，但最终都作用于核内转录因子而导致心肌细胞肥厚，所以本研究以它们的共同作用目标一心肌肥厚为终点，探讨在不同的机制下引起的肥厚模型中是否所有靶基因信号均有表达。 一、Gaq过度表达和主动脉结扎动物模型肥厚心肌表型和血液动力学变化 Gaq过度表达转基因的心肌肥厚动物模型是模拟α肾上腺能介导的内源性神经体液因素所致肥厚而没有外源性机械和血流动力学刺激的心肌肥厚机制，体内体外的多项研究均证实，心肌细胞中活化的Gaq亚单位可以导致心肌明显肥厚。其表型如心肌肥厚、胚胎基因ANP/BNP的表达与压 力负荷过重所致心肌肥厚小鼠表现一致，但心脏功能的受抑制与后者相反，其心功能表现明显异于心肌肥厚的代偿表现而呈现：心脏偏心性重构、静息时窦性心动过缓和左室收缩功能减低。这些证据都提示，Gaq及其下游信号均可导致心肌肥厚“失适应”。与此相反，主动脉结扎动物模型所表现得心肌向心性肥厚、左室收缩功能增强等表型则提示心肌肥厚的“代偿适应性”表现。本研究中Gaq转基因小鼠的心室结构的非对称性变化和心脏收缩功能明显减低，ANP表达显著增强，支持其心肌肥厚为“失适应”变化。而主动脉结扎模型表现为收缩压明显升高、左室舒张末压和左心室压力变化最大上升速率也明显升高，左心室呈向心性肥厚，心脏收缩功能显著增强均提示其肥厚心肌的“代偿适应性”变化。研究结果与文献相一致。 二、integrin/melusin/Akt/GSK3β通路与Gaq过度表达致心肌肥厚机制的关系 Gaq转基因动物模型是建立在与生理性肥厚相关而没有外源性机械和血流动力学刺激的基础上的。本试验结果显示：integrin/melusin/Akt/GSK3β通路在Gaq过度表达小鼠动物模型中的表达与对照组没有差异，显示该途径不参与GPCR信号通路的表达传导，提示该结构和代谢基因与内源性神经体液因素参与的致肥厚作用无关。 三、integrin/melusin/Akt/GSK3β通路与压力负荷过重致心肌肥厚机制的关系 机械刺激可以活化体内和体外心肌细胞内的一些信号途径，其中包括GPCR异源三聚体的aGq亚单位途径和P13K/Akt/GSK3β途径。机械牵张刺激介导的integrin/melusin/Akt/GSK3β途径，参与基因均为结构和代谢基因，melusin相当于整合素途径的生物力学感应器，对压力负荷过重产生的负性效应有保护性作用，Akt则是细胞内的信号分子、介导多种细胞类型的细胞大小和生存的关键介质；糖原合成酶激酶3(GSK3)则有一个重要特点是在非刺激状态下的酶催化特性，其所有细胞活性主要在蛋白表达水平进行调节。主动脉结扎致心肌肥厚模型是模拟压力负荷过重情况下所致心肌肥厚病理过程，其作用机制主要为机械牵拉反射刺激，本研究中各关键酶integrin，melusin，磷酸化Akt在主动脉结扎组均显著升高提示该基因均参与压力负荷过重引发的心肌肥厚，而且Melusin mRNA的基因表达与病变心脏的形态和功能有关，即与LVEF呈正相关，与LVEDD呈负相关，提示其可能具有心脏保护性作用，可以作为心脏功能变化的预测因子；与前三种基 因变化相反，磷酸化GSK3β在蛋白水平的表达明显降低，提示其负调节作用参与压力负荷过重的信号转导过程。 长期以来，对Gaq信号通路的研究已经非常充分，但是对integrin/me-lusin/Akt/GSK3β这一完整通路在心肌肥厚机制中的表达，国内外还未见报道，本研究对不同机制下形成的心肌肥厚动物模型该通路的表达检测填补了这一空白。 综上所述，该实验论证integrin/melusin/Akt/GSK3β途径在致心肌肥厚两大主要病理生理途径：内源性神经体液因素所致生理性肥厚和压力负荷过重所致病理性肥厚中的作用机制，结果提示两种致心肌肥厚过程中，该信号通路作用截然不同，结构因子melusin和integrin、代谢因子Akt和GSK3p均不参与Gq通路的肥厚机制，其在Gaq转基因动物模型中均无阳性表达，另一方面也提示，结构基因不参与神经体液因子的病理生理过程。心肌的“适应性”及“失适应性“肥厚参与基因可能各不相同。 1．主动脉结扎术可以成功复制压力负荷过重引起的心肌肥厚动物模型。 2．压力负荷过重引发的心肌肥厚模型左心室呈向心性肥厚、心肌收缩力增强，心功能增强；而Gaq过度表达所致心肌肥厚心室肥厚为非对称性，心肌细胞胚胎基因表达，心脏收缩功能减低。 3．结构基因melusin，integrin和代谢基因Akt，GSK3β在Gaq过度表达组呈阴性表达，提示其不参与G蛋白通路致心肌肥厚的信号转导，结构和代谢基因可能不参与神经体液因素的病理生理过程。 4．结构基因melusin，integrin和代谢基因Akt，GSK3β在压力负荷过重所致心肌肥厚动物模型中均呈阳性表达，其中reelusin，integrin和磷酸化Akt于mRNA和蛋白水平表达增强，而磷酸化GSK3β表达则减低，提示前三者呈正反馈表达，而GSK3β呈负反馈表达，其对心肌肥厚可能有抑制作用。上述基因均参与压力负荷过重所致心肌肥厚病理生理过程。 5．Melusin mRNA表达与LVEDD呈负相关，与LVEF呈正相关，提示其可以预测心脏功能变化。Melusin与压力负荷下所致心肌肥厚和收缩功能损伤有关。 6．心肌肥厚“代偿适应性’肥厚和“失适应性"肥厚参与基因可能各不相同。