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摘要目的：<br>　　本研究实验拟构建针对小鼠TRMU基因mRNA的特异性RNAi慢病毒表达载体，在小鼠胰腺β细胞(Min6细胞)中，从转录水平上抑制TRMU基因的表达，干扰tRNA的修饰，观察β细胞的功能变化来建立一种研究线粒体糖尿病发病机制的细胞模型。本研究有两个主要目标：(1)建立线粒体功能障碍的β细胞系，可用于线粒体糖尿病发病分子机制的研究工作；(2)阐明线粒体功能障碍影响β细胞功能的部分机制。<br>　　方法：<br>　　1、构建TRMU-RNAi慢病毒表达载体本实验选择小鼠TRMU基因作RNA干扰的靶基因，先设计合成针对TRMU基因mRNA不同位点的shRNA序列，再克隆到线性化的pLVX-shRNA2-GFP慢病毒载体上，分别构建出不同靶点的RNAi慢病毒表达载体。<br>　　2、包装生产TRMU-RNAi慢病毒将构建并测序鉴定好的RNAi慢病毒载体质粒与慢病毒包装系统(Lenti-X TMHTX Packaging System)中的辅助质粒一起共转染慢病毒包装细胞，即293T细胞。在293T细胞中包装出具有活性的慢病毒颗粒，浓缩病毒液，用逐孔稀释法进行病毒滴度的测定。<br>　　3、TRMU-RNAi慢病毒对小鼠胰岛β细胞(Min6)功能的影响用包装好的RNAi慢病毒感染Min6细胞，观察细胞出现的形态学变化；实时定量PCR(Real time PCR，RT-PCR)法检测干扰慢病毒对细胞内TRMU基因转录水平的抑制效应，以及干扰tRNA的修饰对tRNA稳定性的影响；激光共聚焦技术对转染和未转染的细胞进行Ca++浓度的检测；对其胰岛素分泌进行检测与分析。同时，设置阴性对照病毒感染组和未感染病毒的正常细胞组做对照。<br>　　结果：<br>　　1、构建TRMU-RNAi慢病毒表达载体本实验成功构建了针对TRMU基因mRNA不同位点的RNAi慢病毒表达载体质粒，经PCR鉴定和测序鉴定干扰片断的碱基序列以及插入的位点完全正确。<br>　　2、包装生产TRMU-RNAi慢病毒将重组慢病毒载体质粒与辅助包装载体质粒一起共转染293T细胞，包装并扩增慢病毒，获得了高滴度慢病毒上清液。<br>　　3、TRMU-RNAi慢病毒对小鼠胰岛β细胞(Min6)功能的影响通过RT-PCR检测RNAi慢病毒感染Min6细胞后，可以高效抑制TRMU基因的表达，并影响了tRNA的稳定性。激光共聚焦技术对转染细胞进行Ca++浓度的检测，发现转染后细胞内Ca++浓度降低。最后，通过胰岛素释放实验证明了RNAi慢病毒感染Min6细胞后，胰岛素分泌水平明显受到了抑制。<br>　　结论：<br>　　构建的特异性RNAi慢病毒能够有效抑制TRMU基因的表达，减少Min6细胞目的基因的mRNA水平，影响了tRNA的稳定性，以及降低其胰岛素的分泌。建立了线粒体功能障碍的β细胞系，可用于线粒体糖尿病发病分子机制的研究工作。<br>