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摘要脊髓小脑型共济失调(spinocerebellar ataxia，SCAs)是一类具有高度临床和遗传异质性的遗传性神经退行性疾病。患病率约为5-10/10万，占神经系统遗传病的10％-15％。多呈常染色体显性遗传，散发性病例亦不少见。随着分子遗传学技术方法的不断更新和应用，迄今已定位31个致病基因位点，克隆21个致病基因，其中以脊髓小脑型共济失调3型/马查多约瑟夫病(spinocerebellar ataxia type3/Machado-Joseph disease，SCA3/MJD)最为常见，约占中国汉族人群中常染色体显性遗传脊髓小脑型共济失调的62.09％。SCA3/MJD致病基因—ATXN3编码区的羧基端含有一段CAG三核苷酸重复序列，正常人的重复拷贝数在12-40次之间，而患者的重复拷贝数可达51-86次。该病有明显的遗传早先现象(aniticipation)，其重复拷贝数与疾病严重程度呈正相关，CAG异常重复拷贝数越多，疾病发病年龄越早，临床表现也越严重。<br>　　本病的发病机制尚未完全阐明。目前认为，本病的发生主要与“毒性功能的获得(gain of toxic function)”机制有关，即:致病基因ATXN3编码蛋白内由于形成异常扩展的多聚谷氨酰胺(polyglutamine，polyQ)肽链，容易错误折叠，并选择性的在特定的中枢神经系统（小脑、脑干、脊髓等）细胞内积聚形成神经元核内包涵体(neuronalintranuclear inclusions，NIIs)而产生细胞毒性作用(cytotoxicity)，最终导致神经元死亡。尽管这些polyQ突变蛋白引起神经元损害的确切<br>　　机制还不十分清楚，但大量研究已证实他们是促成疾病发生发展的始动因素，深入研究致病基因ATXN3及其编码蛋白ataxin-3的表达调控机制有助于了解SCA3的分子遗传学机制，为寻求有效的治疗靶点提供理论依据。<br>　　微小RNA(microRNAs，miRNAs)是一类新发现的内源性非编码小RNA分子，广泛存在于真核生物中，主要由含发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其作用机制主要是通过与靶基因信使RNA(manage RNA，mRNA)的3'端非翻译区(3'untranslation region，3'UTR)种子序列(seed sequence)特异性碱基互补配对结合，从而在转录或转录后水平影响靶基因的表达。近年来，随着对miRNAs研究的不断深入，国外学者日益关注miRNAs在神经退行性疾病特别是在polyQ病基因表达调控中的重要作用。<br>　　Bilen等在SCA3/MJD细胞模型中发现，RNA干扰介导的Dicer基因沉默能明显增强poly扩展突变型ataxin-3蛋白所致的细胞毒性作用，而补给含有细胞所有miRNAs的小RNA片段后，细胞毒性有所减弱。这些信息提示miRNAs可能对SCA3/MJD具有神经保护作用，它们通过在体内一定水平的表达，直接或间接抑制致病蛋白ataxin-3的神经毒性，从而减缓SCA3/MJD的病情。<br>　　近年来，越来越多的研究证实miRNAs能直接或间接靶向调控SCA1、DRPLA、HD等多种polyQ病致病基因的表达，减轻其神经毒性作用，延缓病情进展。那么对于polyQ病中最常见的SCA3/MJD而言，是否存在相似的调节机制？具体调控致病基因ATXN3的miRNA亚型是什么？迄今国内外尚无相关报道。在前期研究中，本课题组成员已应用miRNAs芯片技术筛选获得SCA3/MJD患者与健康对照组外周血清中miRNAs的差异表达谱，并应用生物信息学方法及实时荧光定量PCR技术对其结果进行初步验证，获得可能与致病基因ATX的靶向作用4种miRNAs—miR-29a、miR-125b、miR-25及miR-34b。<br>　　目的:<br>　　在前期研究基础上，进一步了解异常表达miRNAs与ATXN3基因mRNA3'UTR的相互作用，探讨异常表达miRNAs参与调节SCA3/MJD发病的可能分子机制，为进一步阐明SCA3/MJD等polyQ病的分子发病机制，寻求新的治疗靶点提供理论依据。<br>　　方法:<br>　　1.应用Western blot技术检测异常表达的miRNAs对内源性野生型ataxin-3蛋白表达水平的影响;<br>　　2.应用实时荧光定量PCR技术检测所发现miRNA亚型对内源性野生型ATXN3基因mRNA表达水平的影响。<br>　　3.应用酶切连接法构建pmirGLO-ATXN33'UTR荧光素酶报告基因表达载体，应用PCR突变法构建pmirGLO-ATXN33'UTR荧光素酶报告基因突变体;<br>　　4.应用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测异常表达的miR-25对pmirGLO-ATXN33'UTR载体及突变体萤火虫荧光素酶相对活性的影响;<br>　　结果:<br>　　1.Western blot检测发现:予以miR-29a模拟物(mimics)、miR-34bmimics及miR-125b mimics分别上调各相应miRNAs亚型表达水平后，HEK293T细胞系中的内源性野生型ataxin-3蛋白表达水平较negative mimics干预组无明显差异;而miR-25 mimics上调miR-25表达水平后，内源性野生型ataxin-3蛋白表达水平显著低于negative mimics干预组，其结果较siATXN3干预组无明显差异;<br>　　2.实时荧光定量PCR结果显示:予miR-25 mimics上调miR-25表达水平后，HEK293T细胞系中内源性ATXN3基因mRNA表达水平较negative mimics干预组无明显差异;予miR-25inhibitor下调miR-25表达水平后，HEK293细胞系中内源性ATXN3基因mRNA表达水平较negative mimics干预组无明显差异;<br>　　3.应用酶切连接法成功构建pmirGLO-ATXN33'UTR荧光素酶报告基因表达载体，测序结果显示插入的ATXN33'UTR部分序列与NCBI人类基因组库公布的NM_004993序列1-1531bp信息完全一致;应用PCR突变法成功将miR-25与ATXN3基因mRNA3'UTR预测结合靶序列突变并构建pmirGLO-ATXN33'UTR荧光素酶报告基因突变体，测序结果显示成功将靶序列GTGCAAT突变为CTCGATA;<br>　　4.双荧光素酶报告基因检测结果显示:予miR-25 mimics上调miR-25表达水平后，pmirGLO-ATXN33'UTR荧光素酶报告基因表达载体转染组细胞萤火虫荧光素酶相对活性水平显著低于negative mimics干预组，而pmirGLO-ATXN33'UTR荧光素酶报告基因突变体转染组细胞萤火虫荧光素酶相对活性水平较negative mimics干预组无明显差别。<br>　　结论:<br>　　1.首次发现miR-25能降低内源性ataxin-3蛋白表达水平，不能下调内源性ATXN3基因mRNA表达水平，推测miR-25是可能是通过翻译抑制途径来发挥调控作用，对SCA3/MJD疾病具有潜在神经保护价值。<br>　　2.发现miR-25能直接对ATXN3基因进行靶向调控，明确其作用靶点是ATXN3基因mRNA3'UTR的259-266碱基区域。