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摘要水解类鞣质1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖（1,2,3,4,6-Penta-O-Galloyl-Beta-D-glucose，PGG），广泛存在于果蔬、中草药植物中，具有多种生物活性，对人体有免疫调节、营养保健作用。本团队前期研究从桉树叶中提取分离出PGG，也证明了其抗氧化、抗肿瘤、抗衰老作用，但是PGG在人体中的消化情况、降解途径及降解产物尚不明确，有待进一步研究。本文首先对PGG抗氧化和抗肿瘤进行研究;然后拟采用人体肠道菌群对PGG进行体外厌氧发酵，分离纯化和结构鉴定它的降解中间产物和终端产物，明确降解途径;通过制备色谱等方法将PGG重要的降解产物分离纯化，对其进行初步抗氧化活性评价，为深入探索PGG生物活性作用机理提供基础。本论文的研究内容和所得结果如下：<br>　　（1）PGG的体外抗氧化活性化学研究。本文采用清除 DPPH、ABTS自由基及ORAC-FL法评价其抗氧化能力。结果表明：PGG具有良好的抗氧化活性，能有效、快速地抑制溶液中 DPPH和 ABTS自由基，且其抗氧化活性明显优于 Vc和 Trolox,说明PGG具有较强的抗氧化活性。<br>　　（2）PGG的体外抗氧化活性细胞研究。本文建立了PC12细胞氧化损伤模型，探究PGG对PC12细胞增殖的影响及降低H2O2损伤PC12细胞的效果。结果表明：在25~100μg/mL浓度范围内,PGG对PC12细胞没有毒性；经PGG处理的PC12损伤细胞存活率提高，因此，PGG对细胞损伤具有明显的保护作用。<br>　　（3）PGG的抗肿瘤活性研究。选用HCT-116细胞作为研究对象，用不同浓度的PGG处理HCT-116细胞，采用MTT法测定细胞存活率，流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡。研究发现，经不同浓度PGG处理的HCT-116的增殖受到了抑制，并且有剂量依赖性；同时结肠癌S期细胞数量有所增加，说明PGG可引起S期阻滞。此外,早期凋亡的数量大幅上升，说明PGG可以有效地引起结肠癌细胞的凋亡。<br>　　（4）PGG的制备与其在模拟胃肠道环境中的稳定性研究。将在实验室制备得到的PGG，通过HPLC检测纯度，然后加入到人工胃液pH=1.2及人工肠液pH=7.4中，确定PGG在人工胃肠液中的稳定性。结果表明：分离纯化的PGG高效液相色谱检测其纯度＞95％，可用于后续试验。在0～6h中，PGG在模拟胃液pH缓冲液中的稳定性良好，在模拟肠液pH环境中稍微降解，但2h后也趋于稳定。结果表明，PGG在酸性环境弱碱性环境中均较稳定。<br>　　（5）PGG在肠道菌群的厌氧降解研究。配制培养液进行肠道菌群的体外厌氧培养，将一定浓度PGG加入肠道菌群培养液中，在37℃下厌氧培养一定时间。取不同时间段的发酵液，通过离心分离菌，上清用乙酸乙酯提取，干燥提取液，用HPLC检测提取物。所得结果如下：主要为7种化合物，按照降解的先后顺序依次命名为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7。PGG发酵24h后完全降解为P7，即降解终端产物，且随PGG浓度增加，P7的浓度也增加。在1h-24h之间随时间的增长P1-P6（降解中间产物）及P7（终端产物）的量也随之变化。<br>　　（6）PGG的单宁酶酶解结果验证。为了验证PGG在肠道菌群中的降解可能与肠道菌群释放的酶有关，用可以酶解PGG的单宁酶进行酶解，乙酸乙酯提取，干燥提取液，用HPLC检测提取物，液相图谱与PGG肠道菌群发酵液的液相图谱进行对比。结果显示：单宁酶酶解PGG和PGG发酵液的液相对比图显示，PGG酶解产物与PGG发酵降解产物的液相对比图中的P1-P6出峰顺序一致，出峰时间均相同，单宁酶酶解PGG的终端产物为P6，由此分析，PGG的肠道菌群降解可能与菌群分泌的单宁酶有关，而菌群发酵产物中P6属于中间产物，P7才是终端产物，因此菌群发酵液中不只有单宁酶作用于PGG降解，还可能能存在其他酶的作用。<br>　　（7）PGG降解产物的分离纯化和结构鉴定。采用制备色谱分离富集7个PGG降解产物，以ESI-MS检测产物，得到各物质的分子量，推测可能的分子结构。用制备高效液相色谱对PGG降解产物进行分离纯化和富集，采用ESI-MS确定分离纯化出来的各化合物分子量，结果显示：PGG降解产物的分子量依次为788、636、484、332、170、126，其中P2和P3的分子量均为636，二者可能为同分异构体，而P1和P2(3)、P4、P5之间分子量依次相差一个没食子酸残基（152），由此推测可能的化合物名称依次为为TGG(4GG)、TriGG（3GG）、DGG(2GG)、MGG(1GG)；P6和P7均符合没食子酸和邻苯三酚的分子量大小，经与标准物质比较，确定P6为没食子酸(GA)，P7为邻苯三酚（PGA）。P1到P5的物质结构还有待进一步确定。<br>　　（8）PGG降解产物的抗氧化活性检测。用清除DPPH、清除ABTS自由基和ORAC法进行降解产物的抗氧化活性评价，结果显示：清除DPPH自由基法中，清除率达50%时，各化合物所需浓度TriGG＞DGG＞PGG＞TGG＞GA＞MGG＞PGA，DGG与TriGG的IC50值差异不大。在清除ABTS自由基中，所有降解产物IC50均小于PGG。ORAC法显示，自由基吸收能力GA＞PGG＞PGA＞MGG，而TGG、TriGG、DGG均与PGG活性相似。三种抗氧化活性评价方法测定PGG各降解产物均有较强的抗氧化能力，有些产物甚至比PGG本身抗氧化能力更强。说明PGG在肠道菌群发酵降解后产物可能会提升其抗氧化活性。