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碱茅(Puccinelliatenuiflora)MYBAS1-like基因的克隆与功能分析

摘要MYB(v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog)类转录因子是转录因子家族成员之一,其结构特点是包含 MYB结构域。它参与植物应对大自然中生物、非生物胁迫应答反应。本研究以碱茅(Puccinellia tenuiflora)转录因子成员PutMYBAS1-like为研究对象,对碱茅(Puccinellia tenuiflora)PutMYBAS1-like转录因子的活性及其在非生物胁迫下的表达特性进行深入研究。主要结果如下:<br>  1.本研究中,以PutSnRK2为“诱饵”蛋白通过酵母双杂交技术筛选与其有相互作用的蛋白,利用差异显示法,在NaHCO3逆境胁迫下的碱茅(Puccinellia tenuiflora)的cDNA文库中克隆得到一段MYB基因片段,通过RT-PCR、RACE技术克隆获得了PutMYBAS1-like的全长序列。生物信息学表明:该基因序列包含一个522bp的ORF阅读框,编码173个氨基酸;其N端含有一个MYB特征结构域约45个氨基酸,蛋白分子量大小约为19.68kDa,因与二穗短柄草(Brachypodium distachyon)MYBAS1-like基因同源性较高,命名为PutMYBAS1-like(Alternative splicing MYB transcription factor)。<br>  2.利用实时荧光光定量RT-PCR方法分析了PutMYBAS1-like基因在NaHCO3、NaCl和PEG等处理条件下的表达情况。结果表明,在这些胁迫下,PutMYBAS1-like基因在叶、根中均受到显著诱导。在叶中,呈现先下调后回升趋势;在根中,都表现出上调趋势。说明PutMYBAS1-like基因与逆境胁迫应答有一定的关系。<br>  3.采用酵母单杂交技术验证PutMYBAS1-like具有转录活性以及转录活性区域在第93aa-143aa。<br>  4.构建了pBS-PutMYBAS1-like-GFP植物表达载体,利用基因枪轰击法将pBS-PutMYBAS1-like-GFP导入洋葱表皮细胞,结果显示PutMYBAS1-like定位于细胞核。<br>  5.同时构建了pBI121-PutMYBAS1-like植物过表达载体,获得PutMYBAS1-like过表达拟南芥株系,通过PutMYBAS1-like过表达拟南芥在非生物胁迫(NaCl、NaHCO3、PEG)的表型分析,结果表明:在NaCl、NaHCO3、PEG胁迫下,过表达PutMYBAS1-like拟南芥可以增强对盐、碱以及干旱的耐受性。

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