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摘要第一部分瞬时受体通道蛋白C5在结直肠癌耐药中的作用<br>　　目的：探讨瞬时受体通道蛋白C5（TrpC5）在结直肠癌耐药中的作用。<br>　　方法：选择72例接受一线含氟尿嘧啶（5-Fu）化疗的晚期结直肠癌患者，根据实体瘤的疗效评价标准判断化疗疗效，分为完全缓解（CR）、部分缓解（PR）、稳定（SD）和进展（PD）。免疫组化检测肿瘤组织中 TrpC5蛋白的表达，分析其表达水平与临床、病理因素的关系以及与化疗疗效的关系；选择人结直肠癌野生细胞株（HCT-8、LoVo）及其所对应的耐5-Fu细胞株（HCT-8/5-Fu、LoVo/5-Fu），MTT法检测四株细胞对5-Fu的半数致死浓度（IC50），real-time PCR法及western-blot法分别检测四株细胞的TrpC5的mRNA及蛋白表达水平；通过镧离子激活实验证实耐药细胞中TrpC5的功能；通过shRNA下调耐药细胞的TrpC5表达，MTT检测其IC50值的变化。<br>　　结果：2周期化疗后，有28个病例疗效为CR/PR（有反应者），44个病例疗效为SD/PD（无反应者）。免疫组化显示，TrpC5在结直肠癌组织中均有不同水平的表达。卡方分析显示，TrpC5的表达水平与患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤分化均无关（P>0.05），与化疗疗效显著相关，在有反应者中TrpC5高表达和TrpC5低表达分别为9例和19例，而无反应者中TrpC5高表达和TrpC5低表达分别为31例和13例（p<0.05）；MTT结果显示，HCT-8/5-Fu、LoVo/5-Fu对5-Fu的IC50分别为186.6 mg/L(95%可信区间(95%CI):39.6-878.3 mg/L)及38.7 mg/L(95%CI:34.6-43.3 mg/L)，显著高于野生细胞HCT-8(IC50:3.1mg/L,95%CI:2.2-4.3 mg/L)及LoVo（IC50:0.4mg/L,95%CI:0.4-0.5mg/L）（p<0.05）；Real-time PCR及western-blot结果显示，耐药结直肠癌细胞中TrpC5的mRNA水平及蛋白水平均显著高于野生细胞（p<0.05）；镧离子通过激活TrpC5可引起耐药直肠癌细胞内钙离子的显著增加，而对野生细胞内钙离子水平无显著影响，对耐药细胞内钙离子水平的影响可被 TrpC5特异性抗体抑制；shRNA下调耐药细胞HCT-8/5-Fu及LoVo/5-Fu中TrpC5表达后，其IC50分别降为17.5mg/L(95% CI:5.8-53.3mg/L)和5.5 mg/L(95%CI:3.9-7.6 mg/L)，显著低于HCT-8/5-Fu及LoVo/5-Fu（p<0.05）。<br>　　结论：与野生结直肠癌细胞相比，耐药细胞中存在高表达的功能型TrpC5，对其耐药性状维持起关键作用。<br>　　第二部分瞬时受体通道蛋白C5诱导结直肠癌耐药的机制研究<br>　　目的：研究TrpC5在结直肠癌耐药中的作用机制。<br>　　方法：选择人结直肠癌野生细胞株 HCT-8、LoVo及其所对应的耐5-Fu细胞株HCT-8/5-Fu、LoVo/5-Fu，western-blot法检测四株细胞的TrpC5及Wnt/β-catenin通路蛋白（核β-catenin、核Cyclin D1）的蛋白表达水平；以XAV939抑制耐药细胞的Wnt/β-catenin通路，MTT检测其 IC50值的变化；分别以氯化锂激活野生细胞的Wnt/β-catenin通路和以XAV939抑制耐药细胞的Wnt/β-catenin通路，western-blot法检测细胞TrpC5蛋白表达水平的变化；通过shRNA下调耐药细胞的TrpC5表达，构建TrpC5过表达质粒pCMV-TrpC5并转染野生细胞，筛选稳定过表达TrpC5细胞株， western-blot法检测上调及下调TrpC5表达后，Wnt/β-catenin通路蛋白表达水平变化。<br>　　结果： Western-blot结果显示，耐药细胞中 Wnt/β-catenin通路蛋白的水平均显著高于野生细胞（p<0.05）；XAV939抑制耐药细胞的 Wnt/β-catenin通路可显著减少β-catenin、Cyclin D1的核聚集，LiCl激活野生细胞的Wnt/β-catenin通路可显著增加β-catenin、Cyclin D1的核聚集；以氯化锂激活野生细胞Wnt/β-catenin通路和以XAV939抑制耐药细胞Wnt/β-catenin通路后，TrpC5蛋白表达水平均无明显变化变化；shRNA下调耐药细胞的TrpC5表达可降低β-catenin、Cyclin D1的核聚集，上调野生细胞的TrpC5表达可增加β-catenin、Cyclin D1的核聚集；MTT结果显示，XAV939抑制耐药细胞HCT-8/5-Fu、LoVo/5-Fu的Wnt/β-catenin通路后，其IC50分别降为27.2 mg/L(95% CI:24.8-29.7mg/L)和3.7 mg/L(95%CI:2.7-5.0mg/L)，显著低于HCT-8/5-Fu及LoVo/5-Fu（p<0.05）。<br>　　结论：与野生结直肠癌细胞相比，耐药细胞中同时存在TrpC5的高表达和异常激活的Wnt/β-catenin通路，TrpC5通过激活Wnt/β-catenin通路诱导耐药。<br>　　第三部分瞬时受体通道蛋白C5对结直肠癌糖酵解的调控作用<br>　　目的：研究TrpC5在直肠癌中对糖酵解的调控作用。<br>　　方法：选择72例接受一线含5-Fu化疗的晚期结直肠癌患者，根据实体瘤的疗效评价标准进行疗效判断，选择葡萄糖转运蛋白-1（Glucose transporter1, GLUT1）以及葡萄糖消耗作为反映有氧酵解水平的指标，免疫组化检测肿瘤组织中GLUT1的表达，分析其表达水平与临床、病理因素的关系以及与化疗疗效的关系；选择人结直肠癌野生细胞株HCT-8及其所对应的耐5-Fu细胞株HCT-8/5-Fu，real-time PCR法及western-blot法检测细胞的葡萄糖转运蛋白GLUT1的mRNA及蛋白表达水平；通过shRNA下调耐药细胞的TrpC5表达，real-time PCR法及western-blot法检测GLUT1的 mRNA及蛋白表达水平变化；以 XAV939抑制耐药细胞的 Wnt/β-catenin通路， western-blot法检测GLUT1及核c-Myc的表达水平变化。<br>　　结果：2周期化疗后，有28个病例疗效为CR/PR（有反应者），44个病例疗效为SD/PD（无反应者），针对结直肠癌肿瘤组织的免疫组化显示，TrpC5和GLUT1蛋白主要位于细胞膜，在44例无反应者中，有21例存在两者的共同高表达，而在28例有反应者中，仅有4例存在两者的共同高表达，两者的表达水平正相关，且其高表达与化疗失败显著相关；Real-time PCR及western-blot结果显示，耐药结直肠癌细胞中GLUT1的mRNA水平及蛋白水平以及葡萄糖消耗水平均显著高于野生细胞（p<0.05）；shRNA下调耐药细胞的TrpC5表达可降低GLUT1的表达水平及葡萄糖消耗；XAV939抑制耐药细胞的Wnt/β-catenin通路也可降低GLUT1的表达水平。<br>　　结论：结直肠癌中， TrpC5与 GLUT1的表达水平正相关， TrpC5可通过Wnt/β-catenin通路影响GLUT1的表达。TrpC5与GLUT1的高表达与耐药正相关。