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摘要乳腺癌是女性最常见恶性肿瘤,全世界每年发病人数己超过170 万,每年约有52万患者死于乳腺癌.近年来,我国乳腺癌患者的发病率明显增高,已超过肺癌跃居女性恶性肿瘤发病率的第一位,乳腺癌占到所有女性癌症的15%,并且死亡率和年龄标准化发病率逐年上升.尽管手术、放疗、化疗和内分泌治疗效果明显,但对患者的损伤较大,造成身体和心理上的伤害.肿瘤免疫治疗具有特异性强、副作用小的特点,是近年来研究的热点.<br>　　在肿瘤免疫治疗中,应用肿瘤特异性 T 淋巴细胞杀伤肿瘤具有良好的前景.寻找能被 T 细胞识别的靶抗原是治疗的关键.黑色素瘤相关抗原(Melanoma associated antigen，MAGEs)属于癌睾丸抗原(Cancer/testis antigen,CTA)亚家族,是一种肿瘤相关抗原,具有免疫原性和表达限制性.MAGE-A 是目前研究最广泛的家族,由A1-A12共12个成员构成.MAGE-A抗原能被CTL细胞所识别,从而诱导对相应肿瘤细胞的特异性杀伤,因此,MAGE-A 是肿瘤特异性免疫治疗中有前景的靶分子.有关应用MAGE-A作为靶抗原治疗肿瘤的研究近年来已有广泛的报道.<br>　　肿瘤免疫治疗的效果不仅要求靶抗原表达限制性,同时还取决于靶抗原表达率和表达量.MAGE-A11 在乳腺癌细胞中的表达呈异质性,有的细胞高表达,有的低表达,有的不表达,在免疫治疗中这种异质性会导致部分肿瘤细胞逃逸,最终影响治疗效果.如果能诱导所有乳腺癌细胞均表达 MAGE-A11,便会克服这些限制.近年来,有关文献已经报道了通过提高肿瘤抗原的表达,提高细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicity T lymphocyte，CTL)的杀伤功能.但是这个策略,主要应用在血液系统肿瘤中,在实体瘤中,特别是乳腺癌中尚未见报道.<br>　　MAGE-A亚家族基因的表达受启动子甲基化调控.表观修饰药物能提高肿瘤抗原的表达,进而提高肿瘤特异性 T 细胞对肿瘤细胞的杀伤功能.地西他滨和5-氮杂胞苷,是常用的去甲基化药物,其能够促进MAGE-A基因表达.尽管这两种药物在肿瘤的治疗中表现了良好的缓解效果,但副作用较大,在溶液中不稳定.另外,由于实体瘤生长速度缓慢,并且这两种药的半衰期较短,它们在实体瘤中的效果不佳.因此,迫切需要一种新的针对实体瘤的低毒的去甲基化药物.Zebularine 是一种新的 DNA 甲基抑制剂,具有广谱抗肿瘤效果,副作用低.而且能诱导某些沉默基因例如p21再表达.但是,Zebularine对MAGE-A的表达是否有影响,尚未见报道.<br>　　肿瘤免疫逃逸重要的两个途径是肿瘤抗原缺失和免疫抑制.肿瘤细胞可表达多种免疫抑制信号蛋白,通过介导免疫细胞功能紊乱和诱导细胞凋亡,逃避免疫系统的攻击.程序性死亡配体1(Programmed cell death ligand 1,PD-L1)是一个重要的细胞抑制分子.研究发现,PD-L1在多种肿瘤中表达,并与患者的不良预后相关.肿瘤细胞表达的PD-L1与T细胞表面的程序性死亡受体1(Programmed death1,PD-1)结合,抑制T细胞的活化和增殖,进而导致T细胞功能异常.PD-1/PD-L1作为重要的免疫抑制检查点,发挥着特异性的负性免疫调节作用,是药物干涉以及抗肿瘤免疫治疗的靶分子之一,具有潜在的应用价值.通过阻断二者间的相互作用来提高免疫应答,在肿瘤治疗广泛被应用,展示了较好的应用前景.<br>　　综上所述,我们首先根据MAGE-A11的氨基酸序列,筛选了一系列源于MAGE-A11的候选表位肽,并鉴定寻找能激发CTL免疫应答的多肽.然后通过去DNA甲基化药物诱导乳腺癌细胞表达MAGE-A11,并评估表达增高的MAGE-A11是否能增强抗原特异性T细胞的识别和杀伤作用.最后联合PD-L1阻断剂与DNA甲基化药物提高CTL的抗肿瘤作用,力求发挥免疫治疗的最佳效果,为乳腺癌的免疫治疗奠定基础.主要研究结果如下:<br>　　第一部分 肿瘤抗原MAGE-A11表位多肽的预测、合成及免疫效果鉴定<br>　　目的:通过预测MAGE-A11的HLA-A*0201限制性表位根据氨基酸序列合成抗原肽,并筛选鉴定,寻找能激发 CTL 免疫应答的多肽,为乳腺癌的疫苗设计和免疫治疗奠定基础.<br>　　方法:<br>　　1使用生物信息学预测工具对MAGE-A11的HLA-A*0201限制性表位进行预测,合成候选表位肽.经高效液相色谱技术(High performance liquid chromatography,HPLC)分析纯度,经质谱分析其分子量.<br>　　2通过间接荧光标记法检测候选抗原表位肽与HLA-A*0201分子相对亲和力和稳定性.<br>　　3光镜下观察体外培养的成熟树突细胞(Dendritic cell,DC)形态,流式细胞术检测成熟细胞分子表型.<br>　　4 ELISPOT实验检测抗原肽诱导的具有分泌IFN-γ能力的特异性 CTL频数.<br>　　5 CCK-8实验检测诱导的特异性CTL对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-453、MDA-MB-231和BT-549的杀伤功能.<br>　　结果:<br>　　1. 经过综合比较,最终筛选出 5 条候选多肽 P221(ILHDKIIDL)，P225(KIIDLVHLL)，P350(FLFGEPKRL)，P384(FLWGPRAHA)，P421(ALREEGEGV)进行合成.<br>　　2.新合成的5条抗原多肽经HPLC分析纯度均达到95%以上,质谱分析结果显示合成多肽的分子量与理论值相符合，证明合成的多肽是实验所需要的目的多肽.<br>　　3.多肽P221与HLA-A * 0201分子具有最高的亲和力,依次是P350和P384，P421亲和力最低.稳定性方面,多肽P350表现出最高的稳定能力(DC50 =8h),其次是P221,P384,稳定性最差的是P225,DC50值小于2h.<br>　　4.分离培养外周血单个核细胞,经贴壁去除悬浮细胞.显微镜下观察细胞体积较小,贴壁生长,多为圆形，均匀散在分布,有少量半悬浮细胞.经诱导分化为成熟树突细胞后细胞胞体增大、形态不规则、表面粗糙有毛刺状突起.<br>　　5.流式细胞术检测未成熟和成熟DC表面CD1a、CD83、CD80和CD86 表型变化.抗原刺激前,DC表面共刺激分子CD1a和CD83阳性率分别为 5.73±3.22%、9.21±4.18%.CD80和CD86阳性率分别为5.94±4.13%、3.37±2.95%.抗原刺激后CD1a和 CD83阳性率分别为68.86±9.78%、45.67±10.98%.CD80和CD86阳性率分别为58.81±8.72%、59.75±5.37%.<br>　　6. 经体外诱导的不同健康者来源的CTL,ELISPOT试验显示P221、P350、P384均能刺激产生一定数量、释放IFN-γ的特异性CTL.其中P350和P384在供者1、2中效果较好,P221和P350在供者3中效果较好.<br>　　7.细胞毒性试验结果显示,多肽P221、P350和P384诱导的CTL,可以裂解表达MAGE-A11阳性的MCF-7和MDA-MB-453细胞,但不能裂解 MAGE-A11 阴性的 MDA-MB-231 和 BT-549 细胞.在 MCF-7 和MDA-MB-453 细胞中,效应细胞的特异性杀伤百分率随 E/T 比值(从10:1到40:1)的升高而升高.<br>　　8.用HLA-A2单克隆抗体封闭后,CTL对MCF-7及MDA-MB-453杀伤效应明显降低.<br>　　小结:<br>　　1. 多肽P350是诱导MAGE-A11特异性CTL较理想的多肽.<br>　　2.多肽诱导的CTL对乳腺癌细胞的杀伤具有HLA限制性.<br>　　3.多肽诱导的CTL可以杀伤表达MAGE-A11的乳腺癌细胞.<br>　　第二部分 去甲基化治疗对乳腺癌细胞 MAGE-A11 表达的调节及其对CTL杀伤活性影响<br>　　目的:研究Zebularine对乳腺癌细胞中MAGE-A11表达的影响,观察联合应用Zebularine和CTL对乳腺癌细胞的体外杀伤作用.<br>　　方法:<br>　　1通过PCR和Western Blot技术检测Zebularine对乳腺癌细胞MCF-7、MDA-MB-453、MDA-MB-231和BT-549中MAGE-A11表达的影响.<br>　　2观察Zebularine处理前后,乳腺癌细胞和抗原特异性T细胞增殖活性的变化.<br>　　3通过CCK-8实验和IFN-γ检测实验,观察Zebularine对抗原特异性 CTL的抗肿瘤效果的影响.<br>　　4转染siRNA后,MCF-7和MDA-MB-453细胞中MAGE-A11表达均下降后,检测特异性CTL对其杀伤活性的变化.<br>　　5在乳腺癌原代细胞中验证联合应用Zebularine和MAGE-A11特异性CTL对肿瘤细胞的杀伤效果.<br>　　结果:<br>　　1.MAGE-A11 mRNA在MDA-MB-453细胞中相对高表达,在MCF-7细胞中低表达,在MDA-MB-231细胞和BT-549细胞中不表达.在MCF-7和MDA-MB-453细胞中,50μM Zebularine可以提高MAGE-A11表达,在MDA-MB-231细胞和BT-549细胞中,50μM Zebularine可以诱导MAGE-A11再表达.100μM Zebularine能诱导MAGE-A11表达明显提高(P<0.01).<br>　　2.MDA-MB-231和BT-549细胞均不表达MAGE-A11蛋白.Zebularine (50μM)可以诱导MAGE-A11表达.在MCF-7和MDA-MB-453细胞中，Zebularine对MAGE-A11表达的影响呈剂量依赖性.<br>　　3.Zebularine对乳腺癌细胞增殖活性的影响表现为时间依赖性和剂量依赖性.Zebularine作用MCF-7、MDA-MB-453、BT-549和MDA-MB-231细胞72h后,细胞增殖活性明显降低的浓度分别为100μM,50μM,50μM，25μM.<br>　　4.MCF-7细胞和MDA-MB-453细胞表达MAGE-A11,在没有Zebularine诱导的情况下,也能被识别杀伤.但经Zebularine处理后,能够提高CTL的杀伤活性,特别是在靶效比为20:1和40:1时.MDA-MB-231和BT-549细胞未经Zebularine处理时,不表达MAGE-A11,无法被CTL识别杀伤.经过Zebularine处理后,可观察到肿瘤细胞被CTL杀伤.<br>　　5.经过转染后MCF-7和MDA-MB-453细胞,MAGE-A11表达下调后,在同一靶效比情况下,CTL对MCF-7和MDA-MB-453细胞的杀伤率明显低于未转染组(P<0.05).<br>　　6. Western blot实验结果显示,乳腺癌原代细胞表达MAGE-A11,经Zebularine(100 μM)处理3天后,MAGE-A11表达升高.联合应用Zebularine和MAGE-A11特异性CTL组的平均溶解率达64%,明显高于两者单独使用组.<br>　　小结:<br>　　1.DNA去甲基化抑制剂Zebularine可以诱导乳腺癌细胞中MAGE-A11的表达升高或再表达.<br>　　2.乳腺癌细胞中MAGE-A11表达升高,可提高抗原特异性CTL细胞的识别和杀伤.<br>　　3. 联合应用Zebularine和抗原特异性CTL细胞可提高对乳腺癌细胞株和原代细胞的杀伤效果.<br>　　第三部分 联合PD-1/PD-L1抑制剂和去甲基化药物对CTL细胞杀伤的影响<br>　　目的:观察PD-L1单抗联合Zebularine对CTL作用于乳腺癌细胞的体外杀伤效应,为进一步的动物试验和临床试验提供科学依据.<br>　　方法:<br>　　1流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测乳腺癌细胞表面PD-L1表达和T细胞表面PD-1表达情况.<br>　　2 ELISPOT方法检测阻断PD-L1对T细胞活化的影响.<br>　　3 CCK-8法测定阻断PD-L1前后,CTL细胞对乳腺癌细胞杀伤活性的变化.<br>　　4观察Zebularine对肿瘤细胞表面PD-L1和CTL细胞表面PD-1表达影响.<br>　　5观察联合应用Zebularine和PD-L1单抗对CTL杀伤MDA-MB-231细胞和BT-549细胞的效果.<br>　　6应用乳腺癌组织原代细胞验证联合PD-1/PD-L1抑制剂和去甲基化药物对CTL细胞杀伤的影响.<br>　　结果:<br>　　1. PD-L1分子在MCF-7和MDA-MB-453细胞上不表达,BT-549细胞上低表达,表达率为(8.1±2.5)%,MDA-MB-231 细胞高表达,表达率(43.7±11.4)%.T细胞经负载抗原肽的DC刺激可上调细胞表面PD-1分子的表达.<br>　　2. ELIDPOT实验结果显示,应用阻断PD-L1后T细胞频数与阻断前相比有升高趋势,但是阻断前后相比,差异无统计学意义(P>0.05).<br>　　3.单独阻断PD-L1后,在同一靶效比的情况下,CTL细胞对MCF-7、MDA-MB-453、MDA-MB-231和BT-549细胞的杀伤作用并没有明显提高.<br>　　4. Zebularine处理前后,MCF-7、MDA-MB-453、MDA-MB-231、BT-549细胞PD-L1表达无明显差异,PD-1在CTL细胞上的表达也无明显变化.提示PD-L1在乳腺癌细胞上的表达可能不受DNA甲基化影响.<br>　　5. 选择表达PD-L1的MDA-MB-231和BT-549细胞为靶细胞.在同一效靶比下,CTL+Zebularine+PD-L1 单抗组对乳腺癌细胞裂解率均高于CTL组、CTL +Zebularine组、CTL +PD-L1单抗组,差异有统计学意义(P<0.05),并且随着靶效比的增加,杀伤活性也增高.<br>　　6. CTL+Zebularine+PD-L1单抗组、CTL组、CTL+Zebularine组、CTL+PD-L1 单抗组中细胞培养上清 IFN-γ 含量变化有明显差异，CTL+Zebularine+PD-L1 单抗处理对乳腺癌细胞杀伤中上清 IFN-γ 含量明显高于其他组,差异有统计学意义(P<0.05).<br>　　7.乳腺癌原代细胞经培养后表面表达PD-L1分子.Western blot结果显示MAGE-A11表达阳性.CTL+Zebularine和CTL+PD-L1单抗处理对乳腺癌细胞的杀伤力明显高于CTL组,在这四组中杀伤力最高的是CTL +Zebularine+PD-L1单抗组.<br>　　小结:<br>　　1. Zebularine处理不影响乳腺癌细胞中PD-L1表达.<br>　　2. PD-L1单抗联合Zebularine可提高CTL对乳腺癌细胞系和原代细胞的杀伤作用.<br>　　结论:<br>　　1.源于MAGE-A11的HLA限制性候选肽P350,可与HLA分子稳定结合,并能诱导激发 MAGE-A11 特异性 CTL,杀伤表达 MAGE-A11的乳腺癌细胞.<br>　　2.使用DNA去甲基化药物治疗,可以诱导乳腺癌细胞中MAGE-A11的表达,从而诱导抗原特异性CTL 细胞识别、杀伤乳腺癌细胞株和原代乳腺癌细胞.<br>　　3.阻断PD-L1联合DNA去甲基化药物Zebularine可提高CTL对乳腺癌细胞株和原代乳腺癌细胞的杀伤作用.