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摘要血吸虫病（Schistosomiasis）是一种人兽共患的寄生虫病，其广泛流行于亚洲、拉丁美洲和非洲，严重危害人类健康，制约经济发展。据估计，全球约7.79亿人生活在流行地区，约有2.4亿人感染血吸虫。在我国，主要流行的是日本血吸虫病，随着积极的防治，新发患者呈逐年下降趋势。目前全国有54454多人患有血吸虫病，晚期血吸虫病病人尚存30573例。日本血吸虫病造成的病理损伤主要是血吸虫虫卵沉积在肝脏形成肉芽肿，继而发生肝纤维化甚至肝硬化，并出现严重的临床症状，危及患者生命。对患者实施杀虫治疗后，体内寄生虫虽已被消灭，但肝纤维化仍会持续发展，以至到晚期阶段。因此，在血吸虫病患者进行杀虫治疗后，仍需对其进行管控，以期阻断肝纤维化的持续发展，成为当前血吸虫病防治中值得重视的问题。<br>　　吡喹酮（Praziquantel，PZQ）是目前发现的唯一抗血吸虫的有效药物。由于其安全性高，学龄前儿童和孕妇也被纳入预防性治疗目标人群。研究发现，吡喹酮除了杀虫作用外，还可以调节免疫和抗纤维化。本课题组先期实验显示，在日本血吸虫感染的慢性期，给予小鼠长疗程吡喹酮治疗，可以抑制肝脏纤维化。并且在四氯化碳小鼠肝纤维化模型中，发现吡喹酮通过TGF-β/Smad信号通路抑制肝星状细胞（HSCs）的活化。在肝纤维化的研究领域，人们往往关注肌成纤维样细胞的活化、细胞外基质的合成与分泌、免疫细胞及细胞因子的变化与作用，但是对胶原合成所需原料的来源问题研究较少。<br>　　精氨酸酶（Arginase）是一种首先在肝脏中发现的水解L-精氨酸的酶，在肝脏中起到消除氮的作用。Arginase有两种同工酶：Arginase-1和 Arginase-2。Arginase-1是主要在肝脏中表达的胞质酶，在肝外组织低表达，而作为线粒体酶的Arginase-2恰恰相反，其在肝脏中低表达，在肝外组织高表达。Arginase水解L-精氨酸生成L-鸟氨酸和尿素，L-鸟氨酸为合成胶原（Collagen）的原料L-脯氨酸的前体物质。因此，Arginase可为胶原的合成提供原料。有研究表明，可通过TGF-β/Smad信号通路调节Arginase，进而影响纤维化的进展。<br>　　本实验主要在日本血吸虫感染小鼠模型中，研究吡喹酮通过TGF-β/Smad信号通路对Arginase的调节作用，进一步完善吡喹酮抗纤维化的作用机制。通过体外实验，观察吡喹酮对纤维化相关细胞人肝星状细胞系（LX-2）、小鼠胚胎成纤维细胞（NIH/3T3）和小鼠肾小球系膜细胞（MES13）中Arginase的影响。并利用干扰RNA敲低Smad7，进一步证明吡喹酮调节Arginase是由TGF-β/Smad信号通路介导。<br>　　本研究主要获得以下结果：<br>　　1.日本血吸虫感染小鼠模型中，吡喹酮治疗后循环Arginase活性下降<br>　　为了观察吡喹酮治疗后小鼠血清 Arginase的活性，我们建立日本血吸虫感染12周的小鼠肝纤维化模型，用100μl的300mg/kg剂量的吡喹酮给小鼠灌胃，留取正常组、感染组、杀虫组、治疗组小鼠的血清，用超滤管滤过血清中的氨，利用 Arginase水解精氨酸生成鸟氨酸和氨的原理，检测生成氨的量，然后推算出Arginase的活性。结果显示，感染日本血吸虫后，小鼠血清中Arginase活性显著上升。给予小鼠杀虫治疗后，血清 Arginase活性与感染组相比没有统计学差异。而治疗组与感染组、杀虫组相比，血清 Arginase的活性显著下降。结果表明，吡喹酮治疗可以降低日本血吸虫感染小鼠血清中Arginase的活性。<br>　　2.日本血吸虫感染小鼠模型中，吡喹酮治疗后HSCs的Arginase-1表达下降<br>　　吡喹酮治疗4周后剖杀小鼠，分离纯化原代HSCs，检测Arginase与Smad7的基因与蛋白表达。结果显示，感染日本血吸虫后小鼠HSCs的Arginase-1的基<br>　　因与蛋白表达上升，Smad7的表达下降。对小鼠实施杀虫治疗后，与同期的感染组相比，Arginase-1与Smad7均没有统计学上的差异。而当给与4周的吡喹酮抗纤维化治疗后，Smad7的基因与蛋白水平上升，且Arginase-1基因与蛋白表达下降。但各处理组的HSCs中的Arginase-2的基因表达没有统计学上的差异。这些结果提示，给与慢性期日本血吸虫病小鼠吡喹酮抗纤维化治疗，可以降低HSCs中Arginase-1的含量，并能改善肝脏纤维化。<br>　　3.外源性TGF-β1刺激LX-2细胞，再经吡喹酮诱导后Arginase-1及其下游氨基酸表达下降<br>　　在体外我们利用人肝星状细胞系 LX-2细胞观察了吡喹酮对 Arginase的作用，用TGF-β1诱导LX-2细胞24h后，再加吡喹酮刺激24h，培养后收集细胞，分别对Smad7与Arginase的基因和蛋白及细胞内脯氨酸和羟脯氨素的含量进行了检测。结果显示，外源性的TGF-β1可以诱导LX-2细胞Arginase-1表达升高，脯氨酸、羟脯氨酸的含量上升，Smad7的表达下降。经吡喹酮刺激后，Smad7表达升高，Arginase-1及其下游氨基酸的表达水平下降。而Arginase-2的变化没有统计学差异。结果表明：吡喹酮可能通过TGF-β/Smad信号通路抑制肝星状细胞系Arginase-1的表达。<br>　　4.Smad7敲低后吡喹酮失去对Arginase-1的抑制作用<br>　　为了验证吡喹酮是通过上调 TGF-β/Smad信号通路中的 Smad7调节Arginase-1的表达，我们用siRNA干扰 LX-2细胞中的Smad7的基因表达，在敲低Smad7基因表达后再用吡喹酮刺激LX-2细胞，使用qRT-PCR和Western blot分别检测了LX-2细胞的Arginase-1的基因与蛋白水平。结果显示：吡喹酮刺激后 LX-2细胞中的 Arginase-1的表达下降，而敲低Smad7后吡喹酮则不再抑制Arginase-1表达，同时NC-siRNA干扰后的LX-2细胞经吡喹酮刺激，Arginase-1的表达仍然下降。结果提示：吡喹酮通过靶向上调 Smad7抑制 TGF-β/Smad信号通路，进而抑制Arginase-1的表达，起到抑制纤维化的作用。<br>　　5.外源性TGF-β1刺激纤维化相关细胞，经吡喹酮诱导后Arginase-1及其下游氨基酸表达下降<br>　　为了进一步研究在其它组织纤维化相关细胞系中吡喹酮对Arginase的作用，我们用外源性TGF-β1刺激MES13细胞、NIH/3T3细胞，经吡喹酮干预后，检测 Arginase及其下游氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸的含量水平。结果显示，外源性TGF-β1诱导MES13细胞、NIH/3T3细胞后，细胞中的Arginase-1及脯氨酸、羟脯氨酸的含量升高，Smad7的基因及蛋白水平降低，经吡喹酮刺激后Smad7表达升高，Arginase-1表达降低，且两种氨基酸的含量也均降低。而Arginase-2的基因表达没有差异。由此表明：在 MES13、NIH/3T3细胞中吡喹酮也可能通过TGF-β/Smad信号通路抑制Arginase-1的表达。<br>　　综上所述，吡喹酮可以通过抑制纤维化相关细胞的TGF-β/Smad信号通路降低Arginase-1的表达，从而降低胶原合成原料脯氨酸和羟脯氨酸的含量，抑制纤维化的形成。研究结果进一步揭示了吡喹酮抗肝纤维化的作用机制，并且初步提示吡喹酮对其他组织纤维化，如肺纤维化、肾纤维化，可能同样具有抑制作用。这些研究进一步增加了我们对吡喹酮抗肝纤维化作用机制的认识，为吡喹酮向临床抗纤维化应用转化提供了更多的证据。