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摘要1992年，Wang及其同事发现并且克隆了一种新的细胞膜型分子，当时将其命名为Tactile（T cell activation increased late expression）。随后，在人类白细胞分化抗原协作组会议上将该分子命名为CD96。CD96分子表达于正常T细胞、T 细胞克隆以及某些转化的T 细胞系。外周血T 细胞表达低水平的CD96 分子，活化后其表达明显上调，并在刺激后第6~9天表达达到高峰值。在同种异体抗原刺激的条件下，NK细胞上CD96的表达也发生上调。CD96属于免疫球蛋白超家族，胞膜外区包含3个免疫球蛋白样结构域，共有15个N-连接糖基化位点，还有1个高度O-连接糖基化富含丝/苏/脯氨酸残基的茎状结构域，跨膜区有24个氨基酸残基，胞质区含44个氨基酸残基，并有一个富含碱性/脯氨酸的区域。自克隆CD96分子后的十多年间，由于不清楚其配体，该分子的研究无明显进展。直到2004年，Fuchs及其同事发现NK细胞可通过CD96识别PVR（CD155），促进NK细胞对表达CD155靶细胞的黏附，介导NK细胞对靶细胞表面上CD155的内化作用。 由于PVR（CD155）高表达于某些肿瘤细胞，这一受体系统可能在NK细胞对肿瘤的识别和杀伤中起重要作用。然而，迄今为止对CD96表达和功能的认识还十分有限。 在本课题中，我们通过对CD96分子的生物信息学分析，发现CD96的同源的表达，用RT-P9MC中的表达情况进分子有CD166、CD113、CD226 和CD86，预测CD96分子的配体结合位点为Y177、T186、T245、T246和V249，可结合配体上GLU-LYS-VAL保守序列。也发现CD96分子的胞质区有1个高度保守的ITIM模体，跨膜区有1个能结合跨膜型接头分子带正电的精氨酸残基。这些结果为进一步探讨CD96分子的功能及其信号转导途径提供了重要的启示。 采用PHA刺激上调人T淋巴细胞系HSB-2细胞CD96分子CR成功从该细胞中克隆出CD96分子胞膜外区第一免疫球蛋白V样结构域的cDNA基因，并将该cDNA插入pCDM18-T载体中，经过测序证实该序列正确。从pCD96-D1-T载体中通过双酶切得到CD96-D1cDNA片段，将该cDNA插入到载体pCDM7中构建出pCDM7-CD96-D1真核表达载体。 用脂质体将该载体的质粒转染CHO细胞，表达出CD96-D1-Fc融合蛋白。 用抗-Fc mAb亲和层析柱对CD96-D1-Fc融合蛋白进行纯化。以纯化后的CD96-D1-Fc融合蛋白为免疫原制备了17株抗人CD96-D1 mAbs。用ELISA、FCM、Western Blot等方法对这些抗体进行了鉴定。按常规方法制备腹水，用饱和硫酸铵和阴离子交换层析法对抗CD96-D1 mAbs进行纯化。用过碘酸钠氧化法制备辣根过氧化物酶（HRP）标记的抗CD96-D1 mAbs，以建立测定可溶型CD96的夹心ELISA试剂盒。从抗CD96-D1 mAbs和HRP标记的CD96-D1 mAbs中筛选出最佳抗体配对，即包被抗体采用抗CD6-D1-No.5 mAb，检测抗体采用HPR 标记的抗CD96-D1-No.13mAb。 对包被抗体和HPR 酶标检测抗体的工作浓度进行优化，建立了测定可溶型CD96的夹心ELISA试剂盒。该试剂盒的灵敏度、精密度、准确度和稳定性均令人满意，为可溶型CD96的研究奠定了重要基础。 我们对CD96在多种造血、非造血细胞系以及正常人PB行了系统研究，发现CD96在造血和非造血细胞系中表达十分广泛。D1mAb分子参与NK 细胞对肿瘤细CD96也表达于正常人CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞和NK细胞。在PHA刺激后，CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞上CD96表达明显上调，证实CD96是一种活化表达增加的分子。但PHA对单核细胞CD96的表达上调作用不十分明显，提示不同细胞上CD96分子的表达调节具有不同特点。 对CD96分子对细胞因子分泌的影响也进行了研究，发现用CD96-交联正常人PBMC细胞上CD96受体，能促进PBMC细胞TNF和IL-10的分泌。单独CD96-D1 mAb的刺激并不能始动IL-2的分泌，但CD96-D1mAb能促进同种异体抗原诱导的IL-2分泌。另外，CD96-D1 mAb交联CD96对IFN-γ和IL-4的分泌未发生明显影响。这些结果提示CD96分子在免疫调控、炎症反应、T细胞增殖和分化中可能发挥着重要作用。对CD96介导杀伤作用也进行了研究。在CD96-D1 mAb介导的重导向杀伤实验系统中，观察到CD96-D1 mAb能介导MLC中反应细胞对P815细胞的重导向杀伤。 也发现CD96-D1 mAb能抑制MLC中反应细胞对K562细胞的杀伤，证实CD96为NK细胞的活化性受体，说明CD96胞膜外N-端第一免疫球蛋白V样结构域为参与CD96/CD155结合的主要结构域。 CD96分子具有十分重要的生理功能，尤其是该胞的杀伤和黏附。本文研究了CD96结构、表达和功能，对弄清其信号转导通路和生理功能具有重要意义。