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摘要背根神经节（DRG）细胞的初级传入纤维在脊髓内具有板层特异性终止的排列模式，如传递痛温觉信息的细纤维大部分终止在脊髓背角（DH）的浅层（I 层和II 层），而传递本体觉信息的粗纤维则主要终止于DH 的深层及腹角（VH）。这种模式是脊髓参与感觉信息传递和调节的结构基础，但其形成机制尚不清楚。 已知神经系统内存在多种轴突生长吸引分子和排斥分子，通过和轴突末端生长锥的结合引导其向靶区的正确延伸。其中硫酸软骨素蛋白多糖（CSPGs）是存在于细胞外基质（ECM）中的一种轴突生长抑制分子，能排斥轴突的生长，抑制脊髓损伤（SCI）后轴突的再生。以往对发育阶段的神经系统如视交叉部位给予软骨素酶ABC（ChABC）降解CSPGs 后，可观察到生长轴突延伸方向和终止部位的改变；SCI 后，受损处给予ChABC 处理，轴突再生能力可增加，脊髓功能有所恢复。这种现象提示我们在胚胎发育期，CSPGs 可能也对初级传入纤维的生长具有调节作用，这种调节作用可能参与了初级传入纤维在脊髓内板层特异性终止模式的形成。 基于以上问题，本研究运用形态学方法结合脊髓片培养技术，探讨了初级传入纤维和CSPGs 在小鼠脊髓内的发育特点以及CSPGs 与初级传入纤维的时空关系，观察了降解CSPGs 后初级传入纤维在脊髓内的变化特点。本论文包括以下三个方面的内容： 1．痛温觉和本体觉传入纤维在小鼠脊髓内的不同发育特点 运用免疫荧光双重标记法，在激光共聚焦显微镜下观察胚胎发育期和生后早期传递痛温觉信息的细纤维和传递本体觉信息的粗纤维在脊髓内的发育特点。 结果如下： （1）CGRP 样免疫阳性（LI）痛温觉纤维最早于胚胎（E）16d 进入脊髓，主要分布在DH浅层, E17 时也开始在深层有分布。E18 时上述区域的纤维数量均增加，深层的一些纤维还向浅层发出分支。到生后（P）早期（P1 ~ P3）,CGRP-LI 纤维的分布模式无明显变化,但纤维数量进一步增加,分支状态更为复杂。DH 内侧部和外侧部分别在E16 和E17 时开始发出投射纤维，向腹内侧经灰质后联合终止在对侧脊髓，纤维数量随时间逐渐增加直至生后。 （2）PV-LI 本体觉纤维最早于E15 由后索进入脊髓灰质, 经中间带灰质（IG）内侧延伸并终止在VH 的内侧部和外侧部，一些纤维还终止在IG 内侧区。此后纤维在脊髓内的分布模式基本不变，但数量和密度进一步增加。E17时，PV-LI 纤维终末开始与VH 内的运动神经元形成密切接触，并随时间逐渐增多。 以上结果表明痛温觉和本体觉传入纤维在小鼠脊髓内的终止形成于胚胎晚期和生后早期,并具有时空特异性。这种特异性有助于我们深入理解脊髓内感觉信息传递和调节的形成过程。 2．CSPGs 在小鼠脊髓内的发育特点及其分别与痛温觉和本体觉传入纤维的分布关系 运用免疫荧光染色法，在激光共聚焦显微镜下观察小鼠脊髓内CSPGs 的发育特点及其分别与痛温觉和本体觉传入纤维在脊髓内的分布关系。结果如下： （1）CSPGs 最早出现于E12 的脊髓VH，并随时间延长逐渐向背侧分布，整体表达强度也逐渐增加。到E17 和E18，CSPGs 在DH 已有较多表达，但主要集中于深层，浅层表达缺如或仅有弱表达，在脊髓的整体表达呈腹-背方向递减的趋势。P1 时，CSPGs 的分布无明显变化，但整体表达强度有所下降。 （2）E16 和E17 时，CGRP-LI 痛温觉纤维主要分布在DH 的浅层（I 层和II 层），CSPGs 在此处没有分布，二者没有重叠。E18 和P1 时，CGRP-LI痛温觉纤维在I 层和II 层的数量继续增加，有些纤维延伸并终止在DH 的V层，但CSPGs 的表达始终未超过DH 的III 层，二者虽然在V 层有少量重叠，但CSPGs 此时的腹-背方向递减趋势并不明显。 （3）E16、E17 和P1 时，PV-LI 本体觉纤维由后索进入脊髓，经IG 内侧区向腹侧延伸，终止在VH 的内侧部和外侧部。此期CSPGs 在脊髓内的表达强度由VH 向DH 递减。PV-LI 本体觉纤维在CSPGs 高表达的VH 内始终分布密集。 本部分结果表明CSPGs 在小鼠发育期脊髓内呈浓度梯度分布，与痛温觉传入纤维的分布少有重叠，与本体觉传入纤维的分布存在重叠，提示CSPGs可能对初级传入纤维在脊髓的生长和终止具有选择性抑制作用。 3. CSPGs 对初级传入纤维在脊髓内生长的影响 运用脊髓片培养技术结合免疫荧光染色法，在激光共聚焦显微镜下观察胚胎发育晚期降解CSPGs 后痛温觉传入纤维和本体觉传入纤维在脊髓内的生长变化。结果如下： （1）以0.1 U/ml和0.5 U/ml的ChABC分别处理E18 ~ P0 的小鼠脊髓片后，CSPGs的分布模式都基本不变，但整体表达强度均降低，原本腹-背方向递减的浓度梯度也变得不明显。在高浓度（0.5 U/ml）作用时，CSPGs表达水平的下降更为明显。 （2）用0.1 U/ml终浓度的ChABC处理E18 ~ P0 的小鼠脊髓片后，原本由DH浅层（I层和II层）外侧部向腹内侧延伸的CGRP-LI轴突转为向腹外侧延伸，由DH浅层内侧部向腹外侧延伸的轴突同原本向背侧延伸的分支一起变为向腹侧生长。当ChABC的终浓度为0.5 U/ml时，上述变化更加明显，原本在浅层终止和分支的纤维几乎都转向腹外侧延伸，DH深层（V层）纤维分布模式的变化幅度比浅层更大。 （3）E18 ~ P0 的小鼠脊髓片在0.1 U/ml和0.5 U/ml两种终浓度的ChABC处理后，均未观察到PV-LI本体觉纤维生长模式的改变，PV-LI纤维仍然经由IG内侧区延伸并终止在VH的内侧部和外侧部。 本部分结果表明ChABC可降解小鼠发育脊髓中的CSPGs，改变痛温觉传入纤维在脊髓中的生长模式，但对本体觉纤维的生长没有影响，证实CSPGs对发育阶段初级传入纤维在脊髓内的生长确有选择性排斥作用，其作用强弱和CSPGs的表达强度有关。