CpG ODN107增强人脑胶质瘤U87细胞放射敏感性的体内外生物学活性及机制研究-论文-万方医学网

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CpG ODN107增强人脑胶质瘤U87细胞放射敏感性的体内外生物学活性及机制研究

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摘要目的: 　　脑胶质瘤(gliomas)是颅内最常见的原发性恶性肿瘤,具有发病率、复发率、死亡率高和治愈率低的特点。由于脑胶质瘤呈浸润性生长,手术治疗无法将其完全切除,手术后联合放射治疗是目前脑胶质瘤的首选治疗方法。但脑胶质瘤对射线不敏感或放射治疗一段时间后对射线敏感性降低,放射增敏剂可提高射线对肿瘤细胞的杀伤作用,增强放疗疗效。因此,研制高效的放射增敏剂并阐明其作用机制、靶点,对提高脑胶质瘤的治愈率具有重要意义。 　　NO是最有效的肿瘤放射增敏分子。在缺氧条件下,NO能提高瘤细胞对射线的敏感性,但其对人体具有明显的神经毒性作用。目前认为放射增敏剂主要的作用机制为:促进肿瘤细胞调亡、引起细胞周期阻滞于对射线敏感的G2或G1期、引起细胞自噬性死亡、影响信号传导通路等。 　　CpGODN(CpG oligodeoxynucleotides)是含有未甲基化CpG基序的寡核苷酸片段,是细菌DNA产生免疫刺激作用的最小单位。近年来,CpGODN作为新的放射增敏剂备受关注。实验结果认为CpGODN的放射增敏作用与活化NK细胞、诱导肿瘤细胞分泌NO、TNF-α有关。 　　本实验是国家“重大新药创制”科技重大专项“放射增敏剂候选药物CpGODN107的研究”(2009ZX09103-051)的研究内容之一。以自主研发的CpGODN107为研究对象,探讨CpGODN107对人脑胶质瘤U87细胞的放射增敏作用并阐明其阐明其作用机制,为寻找高效、低毒的放射增敏药物奠定实验基础,同时也为脑胶质瘤治疗提供新的思路。 　　研究内容及方法: 　　一、CpG ODN107增强U87细胞放射敏感性的体内外生物学活性研究 　　1.体外放射增敏作用研究 　　(1)MTT法测定不同剂量的β射线(0、2、4、6、8、10Gy)对U87细胞活力的影响;不同浓度的CpGODN107(1、3、10、30、90μg/mL)对U87细胞活力的影响;CpGODN107联合射线对U87细胞活力的影响。 　　(2)集落形成法评价CpGODN107联合射线对U87细胞增值能力的影响。 　　2.体内放射增敏作用研究 　　(1)建立人脑胶质瘤U87细胞皮下移植瘤裸鼠模型,评价CpGODN107联合射线对移植瘤的生长抑制及肿瘤生长延迟时间的影响。 　　(2)建立人脑胶质瘤U87细胞原位移植瘤裸鼠模型,评价CpGODN107联合射线对裸鼠生存期的影响。 　　二、CpGODN107联合射线对U87细胞增殖与死亡的影响。 　　1.流式细胞术观察CpGODN107联合射线对U87细胞周期的影响。 　　2.流式细胞术观察CpGODN107联合射线对U87细胞凋亡的影响。 　　3.CpGODN107联合射线对U87细胞自噬的影响。 　　(1)透射电镜法观察CpGODN107联合射线对自噬体形成的影响。 　　(2)Westernblot检测CpGODN107联合射线对自噬标志蛋白LC3和beclin-1表达的影响。 　　(3)免疫荧光观察CpGODN107联合射线对U87/GFP-LC3细胞绿色荧光聚集的影响。 　　三、CpGODN107对细胞信号转导通路的影响。 　　1.CpGODN107对TLR9/NF-κB信号转导通路的影响。 　　(1)Griess法检测U87细胞NO生成。 　　(2)ELISA法检测U87细胞iNOS蛋白表达。 　　(3)Realtime-PCR检测TLR9mRNA表达。 　　(4)ELISA法检测U87细胞NF-κB活化。 　　2.CpGODN107对HIF-1α/VEGF信号转导通路的影响。 　　(1)免疫组化法检测脑胶质瘤组织CD34蛋白表达,通过测量内皮细胞表面抗原CD34来计量微血管密度。 　　(2)ELISA法检测U87细胞VEGF蛋白表达、脑胶质瘤组织VEGF蛋白表达。 　　(3)Western blot法检测U87细胞HIF-1α蛋白表达、免疫组化法检测脑胶质瘤组织中HIF-1α蛋白表达。 　　研究结果: 　　一、CpGODN107对人脑胶质瘤U87细胞具有放射增敏作用研究。 　　1.10μg/mLCpGODN107能显著提高U87细胞对β射线敏感性。 　　2.10μg/mLCpGODN107联合射线(5Gy,7MeV)能显著抑制U87细胞活力及增殖能力。 　　3.1.7、5、15mg/kgCpGODN107分别联合单次大剂量射线(10Gy)对U87细胞裸鼠皮下移植瘤生长具有明显的抑制作用,其抑制率分别为27.3％、67.0%和65.5%;同时能够显著延长其TGD和TVQT。 　　4.0.75,0.25and0.083mg/kgCpGODN107分别联合大剂量射线(10Gy)能延长原位移植瘤模型裸鼠的中位生存时间(23d、28d、37.5d)。其中,0.083mg/kg的CpGODN107联合单次大剂量射线(10Gy)能显著延长原位移植瘤裸鼠的生存期。 　　二、CpGODN107对人脑胶质瘤U87细胞周期、凋亡、自噬的影响。 　　1.CpGODN107联合射线可使U87细胞周期阻滞于G1期。 　　2.CpGODN107联合射线不能促进U87细胞凋亡。 　　3.CpGODN107联合射线可诱导U87细胞自噬。 　　(1)CpGODN107联合射线可诱导U87细胞自噬体形成。 　　(2)CpGODN107联合射线可上调自噬标志蛋白LC3和beclin-1的表达。 　　(3)CpGODN107联合射线可诱导U87/GFP-LC3细胞绿色荧光聚集。 　　三、CpGODN107对细胞信号转导通路的影响。 　　1.CpGODN107对TLR9/NF-κB信号转导通路的影响。 　　(1)CpGODN107联合射线可促使U87细胞NO生成。 　　(2)CpGODN107联合射线可上调U87细胞iNOS蛋白的表达。 　　(3)CpGODN107联合射线可上调U87细胞TLR9mRNA表达。 　　(4)CpGODN107联合射线可诱导U87细胞NF-κB活化。 　　2.CpGODN107对HIF-1α/VEGF信号转导通路的影响。 　　(1)CpGODN107联合射线可下调脑胶质瘤组织CD34蛋白表达,降低脑胶质瘤组织微血管密度。 　　(2)CpGODN107联合射线可下调U87细胞VEGF蛋白表达、下调脑胶质瘤组织中VEGF蛋白表达。 　　(3)CpGODN107联合射线可下调U87细胞HIF-1α蛋白表达、下调脑胶质瘤组织中HIF-1α蛋白表达。 　　研究结论: 　　1.CpGODN107能增强人脑胶质瘤U87细胞对射线的敏感性。 　　体外实验结果表明,10μg/mLCpGODN107联合射线能明显降低脑胶质瘤U87细胞活力及细胞增殖能力; 　　体内实验结果表明,5mg/kgCpGODN107联合射线对U87细胞裸鼠皮下移植瘤生长具有明显的抑制作用,其抑制率高达67.0%;0.083mg/kg的CpGODN107联合单次大剂量射线能显著延长原位移植瘤裸鼠的生存期。 　　2.CpGODN107联合射线可诱导U87细胞阻滞于对射线较敏感的G1期,不能诱导细胞凋亡,但能诱导U87细胞自噬。提示,CpGODN107发挥放射增敏作用与其诱导U87细胞G1期阻滞和诱导细胞自噬性死亡密切相关。 　　3.CpGODN107可显著增加人脑胶质瘤对射线的敏感性。其作用机制可能为TLR9/NF-κB途径介导U87细胞释放放射增敏分子NO;也可能是阻断HIF-1α/VEGF信号通路抑制肿瘤组织周围新生血管的形成。通过双重途径增强肿瘤细胞的放射敏感性,最终达到抑制肿瘤的生长、延长生存期的目的。