检索历史 清除

摘要原壳小球藻 (Chlorella protothecoides) 的叶绿素合成具有两条途径,一条是依赖于光的合成途径(同高等植物类似),另一条是不依赖于光的合成途径(同光合细菌相似).第二条合成途径的关键酶是不依赖于光的原叶绿素酸酯还原酶 (Light-independem protochlorophyllide oxido-reductase,LIPOR.),它在无光条件下催化原叶绿素酸酯D环的还原.已知LIPOR由三个亚基组成,分别由chlL、chiN和chlB所编码.目前,针对LIPOR 及其基因的研究集中在紫色细菌、蓝细菌和衣藻上,然而,小球藻是早期研究叶绿素有光合成途径的模式生物,并且,在无光条件下能高密度异养培养、合成大量叶绿素,在取材和研究背景上具有优势.因此,本论文采用原壳小球藻来鉴定和分析叶绿素无光合成相关基因,有利于比较两种合成途径的异同,特别是在原叶绿素酸酯还原那一步的异同,揭示它们的内在联系.这些研究可为进一步揭示LIPOR 及其催化机理,乃至叶绿素无光合成的分子机制奠定基础.本论文主要从以下几个方面开展研究工作,并取得进展: 1、研究了自养、混养和异养三种培养方式对C.protothecoides CS-41细胞超微结构和组成的影响,以揭示叶绿素无光合成的细胞学基础及其与叶绿体发育的关系.结果表明:与有光合成叶绿素的细胞(自养细胞)不同,藻细胞在异养条件下无光合成叶绿素时,叶绿体的发育是不完全的,蛋白核消失,淀粉粒数目大大增加,类囊体膜变松散,其堆叠程度减小,片层数目减少,进而导致叶绿素合成量减少,且减少的幅度随培养基中葡萄糖浓度的增加而增大.与这一变化相对应的是细胞蛋白质含量的减少和淀粉、脂类含量的增加. 2、对C protothecoides CS-41叶绿体基因组中编码LIPOR三个亚基的chlL、chlN和chlB基因进行了克隆,并对其体内和体外表达进行了特征分析,从转录和翻译水平阐明这三个基因表达及其调控的分子基础.结果表明:(1)PCR克隆了chlL、chlN和chlB基因,测序得到其大小分别为1854 bp、1308 bp和1533 bp,它们在大肠杆菌Ecoli BL21中得到了超量表达,其蛋白产物的大小分别为38 kDa、49 kDa和58 kDa;(2)反转录实验结果显示,chlL基因含有一个长达951 bp的I型内含子,结构与衣藻Chlamydomonas moewusii的psbA基因类似,其自我剪切有可能依赖于光的调控;根据这一基因对应的氨基酸序列构建了ChlL蛋白的三维结构模型,其中含有Fe-S活性中心,结构与固氮酶的NifH亚基很相似;(3)半定量RT-PCR和Western杂交结果表明,LIPOR基因在体内的转录是组成型的,不受光和葡萄糖的诱导,但是有光条件下转录水平是黑暗中的2-3倍,其更倾向于在黑暗中表达,有光条件下细胞中LIPOR蛋白含量较低,但并非完全不表达,有可能这种酶也参与了原叶绿素酸酯的光还原.转录水平和翻译水平上基因表达的差异说明L,IPOR基因的表达可能依赖转录后和翻译后水平的调控. 3、分析了LIPOR基因在不同物种中的密码子使用偏性,构建了LIPOR.基因和16S rRNA基因的系统发育树,以确定C. protothecoides在叶绿素无光合成进化中的地位.结果表明:(1)所有合成菌绿素的物种密码子使用偏性(ENC)与密码子第3位的GC含量(GC3s)负相关,而所有合成叶绿素的物种二者正相关,在C. protothecoides中,UPoR基因的ENC处于中间水平,但是GC3s偏小,说明其进化过程中GC至AT的突变压很高;(2)系统发育树分析表明,C. protothecoides的LIPOR进化介于蓝细菌和高等植物之间,与其物种进化地位一致.