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摘要目的：<br>　　 艾滋病是目前对人类社会威胁最大的传染性疾病之一。由于HIV-1存在高水平的遗传变异性，尽管抗病毒药物已经普遍应用于艾滋病的治疗，但多年来艾滋病的防治及疫苗的研究并未取得突破性进展。最新评估报告表明，男男性传播已成为HIV-1感染的重要传播途径，男男同性恋是我国今后要重点关注和防治的人群，而且我国人群的遗传背景又与欧美及非洲人种明显不同，其免疫应答极有可能有新的特点。但目前我国对于男男同性恋人群感染HIV-1的分子流行病学等研究还非常有限，针对我国男男同性恋中HIV-1感染者的疫苗和治疗研究缺乏HIV病原学免疫学等基础资料的支持，因此了解男男同性恋原发感染者体内transmitted/founder virus的生物学和基因组特征及病毒进化和传播关系，是今后对于HIV-1高危人群开展防治工作的必要前提。<br>　　 本研究选取21例我国辽宁省男男同性恋人群中HIV-1原发感染病例，采用SGA/S方法获取病毒全基因组序列，从病毒全基因组水平分析男男同性恋人群中HIV-1原发感染者的流行趋势及感染早期病毒的遗传变异水平，明确HIV-1感染早期毒株的病毒学特征，预测原发感染者早期Ⅰ型人类白细胞抗原限制性细胞毒性T淋巴细胞表位并分析其氨基酸多态性，分析与不同疾病进展过程相关的免疫应答特征，为我国HIV-1感染的预防、诊断、监测和治疗提供重要的数据支持。<br>　　 材料和方法：<br>　　 1、研究对象<br>　　 21例从2008年10月开始对800例自愿接受咨询检测的辽宁MSM高危人群队列按1.5个月的随访频率筛查出的原发感染病例。原发感染病例入选标准：进行血清学ELISA筛查实验和wB确认实验，对血清学检测阴性者进行集合PCR核酸检测，满足以下一项或多项条件者①在6个月内HIV抗体开始变阳性者②HIV抗体阴性但HIV RNA阳性者③HIV抗体弱阳性但在两周之内可以重复并OD值较前次升高者④有早期HIV感染的临床症状、HIV抗原阳性及WB抗体检测少于4条蛋白带者。EDTA抗凝收集全血样本，4小时内分离血浆，-80℃冻存。<br>　　 2、血浆样本RNA的提取<br>　　 病毒载量大于104c/ml的血浆样本，直接参照QLAamp（R）Viral RNA Mini Kit（Qiagen）提取病毒RNA。对于载量小于104c/ml的血浆样本，先进行富集（4℃，23600g离心1小时）以获得浓度较高的血浆RNA，再参照QIAamp（）Viral RNA Mini Kit（Qiagen）提取RNA。以280ul血浆提取病毒基因组RNA，提取物溶于60ul洗脱液中。<br>　　 3、逆转录<br>　　 逆转录反应体系基于SupcrScript（）Ⅲ Reverse Transcdptase Kit（invitrogen）说明书，分两段逆转录获得HIV-1全长基因组。<br>　　 4、SGA方法Nested-PCR<br>　　 对cDNA样本进行极限稀释，根据泊松分布，使PCR扩增产物阳性率小于30％的cDNA稀释度能够确保每个阳性扩增产物中仅有单一样本的可能性大于80％。故本实验用Nuclease-Free Water倍比稀释cDNA，每个稀释浓度均做8个平行孔，进行套式PCR扩增，直至扩增阳性孔少于3个，以保证每个孔中为单一模板扩增产物。<br>　　 PCR扩增体系基于Platinum（）Taq DNA Polymerase High Fidelity Kit（Invitrogen）说明书，分两段套式扩增HIV-1 cDNA全长基因组序列。<br>　　 5、测序及分析<br>　　 使用ABI3130全自动DNA测序分析仪，根据双脱氧终止法用28个引物双向测通HIV-1约9KB的近全长基因序列。用Contig Express（vision 9.0）进行原始的清理和全长基因拼接，出现双峰时，次峰超过主峰的一半，认定该位置为混合碱基。用Bioedit（vision3.3）将序列与HIV DataBase中的参考序列定序进行比较，转换为氨基酸序列，分析变异位置及有无规律性。用MEGA4.1软件以Kimura双参数方法构建全长、env和gag Neighbor-Joining系统进化树，Maximum composite likelihood方法计算序列间的基因距离。<br>　　 6、细胞嗜性分析<br>　　 通过V3环特异的氨基酸并结合网络工具PSSM预测感染毒株的细胞嗜性，在V3环第11至25位氨基酸为S/GXXXGPGXXXXXXXE/D、带正电荷的氨基酸（R/K/H）与带负电荷的氨基酸（D/E）数目差小于5时，可判断为CCR5；如果11和25位氨基酸为R或Q、带正电荷的氨基酸（R/K/H）与带负电荷的氨基酸（D/E）数目差大于5时，可判断为CXCR4。<br>　　 7、Env氨基酸及糖基化位点数目分析<br>　　 用Bioedit软件结合网络工具N-GlycoSite分析计算样本Env蛋白各区氨基酸长度多态性及糖基化位点数目。以RCSB Protein Data Bank蛋白数据库中的HIV-1蛋白三维立体结构为模型利用网络工具SWISS MODEL，构建本实验样本的蛋白三维立体构象。<br>　　 8、HLA-Ⅰ限制性CTL表位的预测<br>　　 利用网络工具IEDB Analysis Resource，根据本实验室前期获得的患者HLA-Ⅰ等位基因分型信息，预测样本的HLA-Ⅰ限制性CTL表位，选取其中IC50低于50nM的表位进行多肽特征和变异分析。<br>　　 9、统计学分析<br>　　 应用SSPS16.0进行统计学分析，病毒载量均转换为对数进行比较。载量、CD4细胞数目、特殊氨基酸和糖基化位点数等不符合正态分布，选取Spearman为相关参数进行两个变量相关分析，P<0.05为显著相关；用非参数秩和检验Wilcoxon参数分析，P<0.05有显著性差异。<br>　　 结论：<br>　　 一、SGA/S方法可以获得原发感染者体内HIV-1单一毒株。<br>　　 二、辽宁地区MSM人群HIV-1原发感染以CRF01AE亚型为主，此外还可见少数B及CRF07BC亚型，并且CRF01AE亚型中明显分为两个分支，分别与我省和东南沿海HIV-1感染人群亲缘关系近。<br>　　 三、辽宁地区MSM人群原发感染HIV-1 Env蛋白某些氨基酸长度多态性及特殊位点的变异会改变蛋白结构，影响免疫识别。<br>　　 四、在辽宁地区MSM人群中引起感染的HIV-1毒株以CCR5嗜性为主；也发现CXCR4嗜性毒株的传播，但其病毒载量水平都相对较低。<br>　　 五、辽宁地区MSM原发感染者HIV-1早期预测到的HLA-Ⅰ限制性CTL表位变异明显，在个别同源毒株感染的病例中发现CTL表位数量变化与病程进展相关。